High molecular diversity of the fungus Guignardia citricarpa and Guignardia mangiferae and new primers for the diagnosis of the citrus black spot

RAPD markers were used to investigate the distribution of genetic variability among a group of Guignardia citricarpa, G. mangiferae, and Phyllosticta spinarum isolates obtained from several hosts in Brazil, Argentina, Mexico, Costa Rica, Thailand, Japan, United States and South Africa. Pathogenic isolates G. citricarpa Kiely (anamorph form P. citricarpa McAlp Van Der Aa) are the etiological agent of the Citrus Black Spot (CBS), a disease that affects several citric plants and causes substantial injuries to the appearance of their fruits, thus preventing their export. Several previous studies have demonstrated the existence of an endophytic species with high morphological similarity to the causal agent of CBS that could remain latent in the same hosts. Consequently, the identification of the plants and fruits free from the causal agent of the disease is severely hampered. The RAPD analysis showed a clear discrimination among the pathogenic isolates of G. citricarpa and endophytic isolates (G. mangiferae and P. spinarum). In addition, a Principal Coordinate Analysis (PCO) based on a matrix of genetic similarity estimated by the RAPD markers showed four clusters, irrespective of their host or geographical origin. An Analysis of Molecular Variance (AMOVA) indicated that 62.8 percent of the genetic variation was found between the populations (G. citricarpa, G. mangiferae, P. spinarum and Phyllosticta sp.). Substantial variation was found in the populations (37.2 percent). Exclusive RAPD markers of isolates of G. citricarpa were cloned, sequenced and used to obtain SCARS (Sequence Characterized Amplified Regions), which allowed the development of new specific primers for the identification of G. citricarpa PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis using a pair of primers specific to pathogenic isolates corroborating the groupings obtained by the RAPD markers, underscoring its efficiency in the identification of the causal agent of CBS.

Marcadores de RAPD foram utilizados para investigar a distribuição da variabilidade genética de linhagens de Guignardia citricarpa, G. mangiferae, e Phyllosticta spinarum isolados em diversos hospedeiros no Brasil, Argentina, México, Costa Rica, Tailândia, Japão, EUA e África do Sul. O fungo Guignardia citricarpa Kiely (Phyllosticta citricarpa McAlp Van Der Aa) é o agente causal da Mancha Preta dos Citros (CBS), uma doença que afeta diversas plantas cítricas, causando dano a aparência dos frutos, prejudicando a exportação. Diversos estudos têm demonstrado a existência de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente a G. citricarpa, e que permanece de forma endofítica no mesmo hospedeiro. Dificultando assim, a identificação de plantas e frutos livres do agente causa da CBS. A análise do perfil de RAPD revelou uma clara discriminação entre isolados patogênicos de G. citricarpa e isolados endofíticos (G. mangiferae e P. spinarum). A Análise de Coordenadas Principais (PCO) baseada na matriz de similaridade genética dos marcadores RAPD, demonstrou a formação de quatro grupos, sem relação com origem geográfica ou com hospedeiros utilizados. A análise de Variância de Marcadores Moleculares (AMOVA) indicou que 62,8 por cento da variação genética é encontrada entre as populações (G. citricarpa, G. mangiferae, P. spinarum and Phyllosticta sp.). Entretanto, variação substancial foi encontrada dentro destas populações (37,2 por cento). Bandas de RAPD exclusivas de isolados de G. citricarpa foram clonadas, sequenciadas e utilizadas na obtenção de SCARS (Sequence Characterized Amplified Regions), que permitiram o desenvolvimento de novos primers específicos para a identificação de G. citricarpa. Reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando este par de primers corroboraram os agrupamentos obtidos pelos marcadores de RAPD, revelando sua eficiência na identificação do agente causal da CBS.

Fungicide resistance and genetic variability in plant pathogenic strains of Guignardia citricarpa / Resistência a fungicidas e variabilidade genética em linhagens patogênicas de plantas Guignardiacitricarpa

Citrus black spot (CBS) is a plant disease of worldwide occurrence, affecting crops in Africa, Oceania, and South America. In Brazil, climate provides favorable conditions and CBS has spread to the Southeast and South regions. CBS is caused by the fungus Guignardia citricarpa (anamorph: Phyllosticta citricarpa) and its control is based on the use of fungicides, such as benzimidazoles. In South Africa, the disease was kept under control for 10 years with benomyl, until cases of resistance to high concentrations of this fungicide were reported from all citrus-producing areas. Azoxystrobin (a strobilurin) has been found effective in controlling phytopathogens, including CBS, in a wide range of economically important crops. The present study investigated in vitro the effects of the fungicides benomyl and azoxystrobin on 10 strains of G. citricarpa isolated from lesions in citrus plants from Brazil and South Africa. Benomyl at 0.5 µg/mL inhibited mycelial growth in all strains except PC3C, of African origin, which exhibited resistance to concentrations of up to 100.0 µg/mL. The spontaneous mutation frequency for resistance to benomyl was 1.25 ï 10-7. Azoxystrobin, even at high concentrations, did not inhibit mycelial growth in any of the strains, but significantly reduced sporulation rates, by as much as 100%, at a concentration of 5.0 µg/mL. Variations in sensitivity across strains, particularly to the strobilurin azoxystrobin, are possibly related to genetic variability in G. citricarpa isolates.

A Mancha Preta dos Citros (MPC) tem ocorrência mundial afetando a produção de citros na África, Oceania e América do Sul. No Brasil, onde o clima é favorável ao seu desenvolvimento, a doença está espalhada nas regiões Sul e Sudeste. O controle da MPC, causada pelo fungo Guignardia citricarpa (anamorfo: Phyllosticta citricarpa) é baseado na aplicação de fungicidas, como os benzimidazóis. Na África do Sul, após 10 anos de controle da doença com o fungicida benomil, os casos de resistência a altas concentrações deste fungicida atingiram todas as áreas produtoras. O fungicida estrolilurina chamado azoxistrobina tem se mostrado eficiente no controle dos fitopatógenos de uma grande variedade de culturas economicamente importantes, incluindo a MPC. Neste trabalho foram investigados os efeitos in vitro dos fungicidas benomil e azoxistrobina em 10 linhagens de G. citricarpa isoladas de lesões em plantas cítricas no Brasil e na África do Sul. Houve inibição do crescimento micelial a 0,5 µg/mL do fungicida benomil entre as linhagens testadas, com exceção de PC3C de origem sul-africana, que apresentou resistência até a concentração de 100,0 µg/mL de benomil. A freqüência de mutação espontânea para resistência ao benomil foi de 1,25 ï 10-7. A estrobilurina azoxistrobina, mesmo em altas concentrações, não inibiu o crescimento micelial dos isolados, entretanto reduziu significativamente a produção de esporos, chegando a 100% de inibição em concentrações de 5,0 µg/mL de azoxistrobina. A variação na sensibilidade das linhagens, principalmente com a estrobilurina azoxistrobina, possivelmente está relacionada com a variabilidade genética dos isolados de G. citricarpa.

Mechanisms and significance of fungicide resistance / Mecanismos e significância da resistência a fungicidas

In this review article, we show that occurrence of fungicide resistance is one of the most important issues in modern agriculture. Fungicide resistance may be due to mutations of genes encoding fungicide targets (qualitative fungicide resistance) or to different mechanisms that are induced by sub-lethal fungicide stress. These mechanisms result in different and varying levels of resistance (quantitative fungicide resistance). We discuss whether or not extensive use of fungicides in agricultural environments is related to the occurrence of fungicide resistance in clinical environments. Furthermore, we provide recommendations of how development of fungicide resistant pathogen populations may be prevented or delayed.

A ocorrência de resistência a fungicidas é uma das mais importantes conseqüências da agricultura moderna. Este fato pode ser resultado de mutações em genes codificadores de resistência a fungicidas (resistência quantitativa) ou a diferentes mecanismos que são induzidos por stresse devido a doses subletais dos produtos utilizados. Estes mecanismos produzem diferentes e variados níveis de resistência (resistência quantitativa). Também é discutido se o uso extensivo de fungicidas em ambientes agricultáveis é relacionado ou não com a ocorrência de resistência em ambientes clínicos. Além disso, também são fornecidas recomendações de como prevenir ou mesmo retardar o desenvolvimento de resistência a fungicidas em patógenos.