Expression in Saccharomyces boulardii of recombinant Toxin-coregulated pilus A subunit (TcpA) of Vibrio cholerae O1

Cholera is endemic in over 50 countries with an estimated mortality of 100,000-120,000. Vaccination is considered the complementary key to prevent and control cholera; therefore, alternative vaccine preparations are needed. Toxin Co-regulated Pilus is part of the toxR virulence regulon, which is necessary for colonization in the intestinal mucosa. In order to express Vibrio cholerae TcpA protein in Saccharomyces boulardii, the expression plasmid pYES2 was constructed by inserting tcpA gene isolated from local Vibrio cholerae Eltor Inaba isolates. The new construct was transferred into Saccharomyces boulardii cells and the expression of tcpA gene was induced from the GAL1 promoter by adding galactose to the medium. The SDS-PAGE and Western blot analysis showed the presence of TcpA in yeast. These results showed that Saccharomyces boulardii is a promising host to express Vibrio cholerae toxin TcpA as the first step in attempt to produce an oral Vibrio cholerae vaccine(AU)

El cólera es endémico en más de 50 países. Se estima una mortalidad entre 100.000 - 120.000 debido a esta enfermedad. La vacunación se considera una medida complementaria para prevenir y controlar el cólera, por lo tanto, se necesitan preparaciones vacunales alternativas a las existentes. El Pili corregulado con la toxina, es parte del regulón de virulencia toxR, y es necesario para la colonización en la mucosa intestinal. Para expresar la proteína tcpA de Vibrio cholerae en Saccharomyces boulardii, se construyó el plásmido de expresión pYES2 insertando el gen tcpA obtenido a partir de aislamientos locales de Vibrio cholerae El Tor Inaba. La nueva construcción se transfirió a las células de Saccharomyces boulardii y se indujo la expresión del gen tcpA a partir del promotor GAL1 mediante la adición de galactosa al medio. El análisis mediante SDS-PAGE y Western blot demostró la presencia de TcpA en levaduras. Los resultados demostraron que Saccharomyces boulardii es un hospedero prometedor para expresar el gen tcpA de Vibrio cholerae como el primer paso en el intento de producir una vacuna oral contra Vibrio cholerae(AU)

Las tecnologías de manipulación de genes humanos como imperativo tecnológico: análisis desde la óptica del principalismo bioético y el principio de la responsabilidad / As tecnologias de manipulação de genes humanos como imperativo tecnológico: análise pela ótica do principialismo bioético e do princípio da responsabilidade / Human gene manipulation technologies as technological imperative: analysis from the perspective of bioethical principalism and the principle of responsibility

Se ejemplifica, mediante el análisis de las nuevas tecnologías de manipulación de genes humanos como la terapia génica y el clonaje, lo que es común a la mayor parte de las ramas de la ciencia: El imperativo tecnológico de aplicar toda la capacidad técnica adquirida sin considerar las implicaciones éticas que éstas puedan presentar. La clonación por transferencia nuclear, por ejemplo, ha comenzado a ser una realidad científica y la presión ejercida por sectores de la comunidad científica y por determinados grupos está creando un imperativo tecnológico contra el que parece imposible oponerse o, al menos, establecer un diálogo reflexivo. Se argumenta que la validez del principalismo bioético anglosajón está limitada a la esfera de los efectos humanos recíprocos, considerando sólo la humanidad presente. Por lo anterior, tecnologías como la terapia génica con células somáticas, pueden ser apoyadas por los principios y no presentan problemas éticos diferentes a los de otro tipo de terapia experimental. Una decisión ética con repercusión para el futuro debe tener en cuenta las razones a favor y en contra de hacer o no hacer una investigación y por ello nuevas bases de sustentaciones teórico-metodológicas más abarcadoras que las del principalismo. Se demuestra la validez del Principio de la Responsabilidad de Hans Jonas que, como evaluación crítica de la ciencia y la tecnología modernas, llama a actuar con cautela y humildad frente al enorme poder transformador de la tecnociencia pues el orden ético está presente, no como realidad visible, sino como un llamado que pide calma, prudencia y equilibrio...

In this paper we exemplified by the analysis of new technologies of manipulation of human genes such as gene therapy and cloning, which is common to most branches of science: the technological imperative to apply all the technical capabilities acquired without considering the ethical implications they may have. Cloning by nuclear transfer, for example, has begun to be a scientific reality and the pressure exerted by sections of the scientific community and certain groups are creating a technological imperative against which it seems impossible to oppose or at least set a reflective dialogue. It is argued that the validity of anglo bioethical principles is limited to the sphere of reciprocal human effects, considering only the present humanity. Therefore, technologies such as somatic cell gene therapy can be supported by the principles and have no ethical problems different from other experimental therapy. An ethical decision with implications for the future must take into account the reasons for and against doing or not doing an investigation and thus new theoretical and methodological bases more comprehensive than the principles. We demonstrate the validity of Hans Jonas' principle of responsibility as and critical evaluation of science and modern technology, called to act with caution and humility in face of the tremendous transforming power of technoscience as the ethical order is present, not reality visible, but as an appeal that calls for calm, caution and balance...

Exemplifica, mediante análise das novas tecnologias de manipulação de genes humanos como a terapia gênica e a clonagem, o que é comum à maior parte dos ramos da ciência: o imperativo tecnológico de aplicar toda a capacidade técnica adquirida sem considerar as implicações éticas que disso podem advir. A clonagem por transferência nuclear, por exemplo, começou a ser uma realidade científica, e a pressão exercida por setores da comunidade científica e por determinados grupos vem criando um imperativo tecnológico contra o qual parece impossível se opor ou, ao menos, estabelecer um diálogo reflexivo. Argumenta que a validez do principialismo bioético anglo-saxão está limitada à esfera dos efeitos humanos recíprocos, considerando apenas a presente humanidade. Dado o exposto, tecnologias como a terapia gênica em células somáticas podem ser apoiadas pelos princípios, e não apresentam problemas éticos distintos aos de outro tipo de terapia experimental. Uma decisão ética com repercussão no futuro deve levar em conta as razões a favor e contra de ser feita ou não uma investigação, e com isso novas bases de sustentação teórico-metodológicas mais abrangentes que as do principialismo. Demonstra a validez do Principio da Responsabilidade de Hans Jonas, que como avaliação crítica da ciência e da tecnologia modernas chama para que se atue com cautela e humildade diante do enorme poder transformador da tecnociência, pois o preceito ético está presente não como realidade visível, mas como um chamado que pede calma, prudência e equilíbrio...

Clonaje de la proteína de choque térmico de 20 kDa de Leishmania amazonensis / Cloning of 20 kDa heat shock protein of Leishmania amazonensis

INTRODUCCIÓN: la inducción de las proteínas de choque térmico constituyen un mecanismo homeostático que protege a las células del efecto destructivo del calor u otras condiciones de estrés ambiental, paralelamente, ellas cumplen importantes funciones celulares. La proteína de choque térmico de 20 kDa se reportó recientemente en Leishmania amazonensis. OBJETIVO: describir la metodología utilizada para realizar el clonaje de las proteínas de choque térmico, lo que permitió acometer estudios de algunas propiedades biológicas. MÉTODOS: la región codificante del gen hsp20 se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores adecuados. El producto amplificado se clonó inicialmente en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y después en el vector de expresión en procariotas pET-28b (Novagen), para obtener proteína recombinante. De manera paralela, el mismo fragmento se clonó en el vector de expresión en eucariotas pcDNA3 (Invitrogen) para obtener un posible preparado vacunal de ADN. Se realizó la secuenciación nucleotídica de los clones obtenidos, con la finalidad de verificar su fidelidad. RESULTADOS: se obtuvieron plásmidos recombinantes que codifican la HSP20 de Leishmania, y permiten la obtención de proteína recombinante y de ADN en forma masiva. CONCLUSIONES: ambos plásmidos fueron útiles para estudiar algunas de las propiedades biológicas de esta proteína. Este acercamiento puede ser de interés en otros trabajos de esta índole y constituir una guía metodológica.

INTRODUCTION: the induction of heat shock proteins is a homeostatic mechanism that protects cells from the deleterious effects of thermal and other environmental stresses. In addition, they have important cell functions. The 20kDa heat shock protein in Leishmania amazonensis was recently reported. OBJECTIVE: to describe the methodology used for cloning of heat shock proteins, which allowed the study of some biological properties. METHODS: the hsp20 gene coding region was amplified by polymerase chain reaction using adequate primers. The amplified product was initially cloned in pCR2.1 vector (Invitrogen) and then in pET-28b vector (Novagen), to obtain recombinant protein. The same fragment was cloned also in the eukariote expression vector pcDNA3 (Invitrogen). The nucleotidic sequencing of the different clones was made, in order to verify their fidelity. RESULTS: the recombinant plasmids that encode HSP20 protein in Leishmania and allow obtaining massively recombinant protein and DNA were produced. CONCLUSIONS: both plasmids were useful to study some of the biological properties of this protein. This approach could be useful for similar research and represent a suitable methodological guideline.

Perspectivas sanitarias prometedoras del clonaje humano / Promisin health perspectives for human cloning / Perspectivas sanitarias prometedoras da clonagem humano

Para evaluar las promesas del clonaje humano -tanto las terapéuticas como las reproductivas- se puede partir de dos puntos de vista pertinentes: el sanitario y el de la bioética laica. El punto de vista sanitario, a través de políticas públicas de prevención y de promoción de salud adecuadas a las condiciones objetivas existentes, busca proteger la población humana de enfermedades innecesarias. El clonaje puede, en principio, ser parte de una política sanitaria, con la condición de que sean respetados los derechos fundamentales del individuo -en particular el derecho a la autodeterminación personal-, los derechos sociales -como la justicia distributiva- y los derechos de tercera generación -que incluyen medidas protectoras de bioseguridad. La bioética laica busca entender la eticidad del clonaje por medio del análisis racional e imparcial de las implicaciones morales de su uso y, si se considera legítimo, proponerlo como medio para proteger la salud humana. A pesar de sus funciones aparentemente muy diferentes, tanto el clonaje terapéutico como el reproductivo buscan responder al desafío del sufrimiento humano innecesario: el clonaje terapéutico, gracias a la técnica que utiliza célulasmadre o estaminales totipotentes, busca producir órganos y tejidos para eliminar el sufrimiento evitable; el clonaje reproductivo puede también paliar formas de sufrimiento humano innecesario y puede, por ende, ser considerado un caso particular del terapéutico.

To evaluate the promises of human cloning, both therapeutic and reproductive, we can start from two pertinent points of view: health and secular bioethics. Under the point of view of health, though public prevention and health promotion policies, adequate to objective existing conditions, they try to protect human population from unnecessary diseases. Secular bioethics seeks to understand the ethics of cloning through rational analysis, free from the moral implications of its use; and if the conclusion is that it is legitimate, to propose it like a tool to protect human health. In spite of their apparently very different functions, both therapeutic cloning and reproductive cloning seek to respond to the challenge of unnecessary human suffering: therapeutic cloning, thanks to the technique that uses totipotent stem cells, seek to grow organs and tissues to eliminate avoidable suffering; reproductive cloning may also diminish forms of unnecessary human suffering and if can, therefore, to be considered a particular case of therapeutic approach.

Para avaliar corretamente as promessas da clonagem humana, tanto as terapêuticas como as reprodutivas, podese partir de dois pontos de vista pertinentes: o ponto de vista sanitário e o ponto de vista da bioética laica. O ponto de vista sanitário, graças a políticas públicas de prevenção e promoção da saúde adequadas às condições objetivas existentes, visa proteger a população humana do adoecimento não necessário. A bioética laica procura entender a eticidade da clonagem através da análise racional e imparcial das implicações morais de seu uso e, se este for considerado legítimo, propôlo como meio para proteger a saúde humana. Apesar de ter aparentemente funções muito diferentes, tanto a clonagem terapêutica como a reprodutiva buscam responder ao desafio do sofrimento humano não necessário: a clonagem terapêutica, graças à técnica que utiliza célulastronco totipotentes, busca produzir órgãos e tecidos para eliminar o sofrimento evitável; a clonagem reprodutiva pode também eliminar formas de sofrimento humano evitáveis e pode, portanto, ser considerada um caso particular da clonagem terapêutica.