RESUMEN
Abstract Background: Osteoarthritis is a complex degenerative disease with several factors contributing to joint damage. Objective: To compare the potential effect of hyaluronic acid (HA) and triamcinolone acetonide (TA), alone or combined, on the in vitro chondrogenic differentiation process of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were divided into four groups: Control, HA, TA, and HA/TA combined. Each treatment group was cultured for 14 days in chondrogenic differentiation medium. The chondrogenic differentiation potential was assessed by histology and immunohistochemistry. Results: The HA and HA/TA-treated MSCs presented histological characteristics similar to native chondrocytes. The extracellular matrix (ECM) of TA-treated MSCs was compact and organized. Glycosaminoglycan staining was intense in Control, moderate in TA, slight in HA/TA, and undetectable in HA. Type II collagen immunoreactivity was high in the TA-treated ECM and MSCs. Conclusions: Histological analysis shows that HA influences morphological development similar to chondrocytes of the MSCs, but with low expression of specific cartilage molecules. The TA promotes formation of a compact and organized ECM.
Resumen Antecedentes: La osteoartritis es una enfermedad degenerativa compleja en la cual varios factores contribuyen al daño articular. Objetivo: Comparar el efecto del ácido hialurónico (HA) y acetónido de triamcinolona (TA), solos o en combinación, en el proceso de diferenciación condrogénica in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Métodos: Las MSCs fueron divididas en cuatro grupos: Control, HA, TA y HA/TA, y cultivadas por 14 días en medio de diferenciación condrogénica para cada tratamiento. El potencial de diferenciación condrogénica fue analizado por medio de histología e inmunohistoquímica. Resultados: Las MSCs tratadas con HA y HA/TA, presentaron características histológicas similares a los condrocitos nativos, y la matriz extracelular (ECM) de MSCs tratadas con TA fue más compacta y organizada. La tinción de glicosaminoglicanos fue intensa en el Control, moderada en TA, ligera en HA/TA, y sin tinción en HA. La inmunoreactividad para colágeno tipo II fue más alta en las MSCs y ECM tratadas con TA. Conclusión: El análisis histológico muestra que el HA influencia un desarrollo morfológico similar a los condrocitos de las MSCs, pero con baja expresión de moléculas específicas de cartílago. La TA promueve la formación de una ECM compacta y organizada.
Resumo Antecedentes: A osteoartrite é uma doença degenerativa complexa, na qual vários fatores contribuem ao dano articular. Objetivo: Comparar o efeito do ácido hialurônico (HA) e Triancinolona acetonida (TA), só ou combinado no processo de diferenciação condrogênica in vitro de células tronco mesenquimais (MSCs). Métodos: MSCs foram divididas em 4 grupos: Controle, HA, TA y HA/TA e cultivadas por 14 dias com meio de diferenciação condrogênica e seus respectivos tratamentos. O potencial de diferenciação condrogênica foi acessado por meio de histologia e imunohistoquímica. Resultados: Histologicamente, MSCs tratadas com HA e HA/TA apresentaram características semelhantes de condrócitos nativos, e a matriz extracelular de MSCs tratadas com TA foi mais compacta e organizada. A coloração para glicosaminoglicanos foi intensa no Controle, moderada no TA, leve no HA/TA e sem coloração com HA. Para os grupos tratamento, a imunoreatividade para colágeno tipo II foi maior nas células e matriz extracelular tratadas com TA. Conclusão: Mediante análise histológica, o HA influenciou o desenvolvimento morfológico semelhante a condrócitos das MSCs, mas com baixa expressão de moléculas específicas de cartilagem. A TA promoveu a formação de uma matriz extracelular compacta e organizada.
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RESUMEN La fibroína de seda es una proteína que ha demostrado ser un biomaterial con gran potencial en medicina regenerativa, por sus características de biocompatibilidad y su amplia posibilidad de modificación estructural permite ser usada como andamio favoreciendo procesos de crecimiento, diferenciación celular y la regeneración del tejido afectado. En este estudio se utilizaron capullos de gusano de seda Bombyx mori L., para la fabricación de películas de fibroína, los capullos fueron desgomados utilizando Na2CO3 0,02M, la fibroína obtenida se disolvió con LiBr 9,3M, el cual fue eliminado mediante diálisis y finalmente la solución de fibroína fue concentrada mediante contradiálisis. La fibroína fue servida en cajas de poliestireno, secadas a 90°C/24 horas y esterilizadas con etanol al 70%. Células madre mesenquimales fueron sembradas sobre estas películas de fibroína e inducidas a diferenciación utilizando un medio condrogénico especifico. La diferenciación fue evaluada por triplicado a los 14 y 21 días mediante extracción de ARN total, síntesis de ADN copia y amplificación por PCR de un grupo de genes específicos de cartílago empleando cebadores específicos. Se fabricaron películas de fibroína estables y resistentes que permitieron el crecimiento y la multiplicación celular, así como la diferenciación condrogénica evidenciada por la expresión de genes condrogenicos, no se afectó la viabilidad ni el recuento celular, las células interactuaron con el andamio evidenciado por el área de tapizado formado sobre la superficie de la película de fibroína. Finalmente se concluye que la fibroína de seda es un biomaterial que puede servir de andamio potencial para la regeneración de lesiones articulares.
ABSTRACT Silk fibroin is a protein that has been shown to be a biomaterial with great potential in regenerative medicine, due to its biocompatibility characteristics and its wide possibility of structural modification can be used as scaffold, favoring growth processes, cell differentiation and the regeneration of affected tissue. Bombix mori L. silkworm cocoons were used to make fibroin films, the silk fibroin were degummed using 0.02M Na2CO3, the obtained fibroin was dissolved with 9.3M LiBr, which was eliminated by dialysis and finally the fibroin solution was concentrated to 17% by counterdialysis. The fibroin was served in polystyrene boxes, dried at 90°C/24 hours and sterilized with 70% ethanol. The mesenchymal stem cells were seeded on fibroin films and induced differentiation using a specific chondrogenic medium. Differentiation was assessed in triplicate at 14 and 21 days by total RNA extraction, DNA synthesis copy and PCR amplification of a group of cartilage-specific genes using specific primers. Stable and resistant fibroin films that allowed cell growth and multiplication were fabricated, as well as the chondrogenic differentiation evidenced by the expression of chondrogenic genes, the viability and the cell count were not affected, the cells interacted with the scaffolding evidenced by the area of upholstery formed on the surface of the fibroin film. Finally, it is concluded that silk fibroin is a biomaterial that can serve as a potential scaffold for the regeneration of joint injuries.
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Amelogenin is one of the enamel matrix proteins secreted by ameloblasts during enamel formation in tooth development. Recent studies showed that the amelogenin is expressed in chondrocyte. Lysosome-associated membrane proteins (LAMPs) have been identified as binding partner proteins to amelogenin and it has been suggested they act as signaling receptors of amelogenin. The purpose of this study is to clarify the localization of amelogenin and LAMPs in growth plate cartilage and cartilaginous nodules in micromass culture. Mouse knee joints including tibia growth plate at 4 weeks old and micromass cultures of limb bud mesenchymal cells after 2 weeks were fixed in paraformaldehyde, routinely processed, sections were cut and immunostained with amelogenin, collagen type II and type X, LAMP-1 and -3. The positive immunoreaction of amelogenin was observed both in proliferation and hypertrophic zone cartilage of growth plate after enzymatic pretreatment in immunostaining. Furthermore, cartilaginous nodules in micromass culture were immunopositive to amelogenin. The chondrocytes in the proliferation zone of the growth plate were immunopositive to LAMP-1 but weakly stained in the chondrocytes of hypertrophic zone. These observations indicate that amelogenin may be present in cartilage matrix produced in vivo and in vitro and amelogenin may involve cartilage formation through the LAMP-1 signaling pathway.
La amelogenina es una de las proteínas de la matriz del esmalte secretadas por ameloblastos durante la formación del esmalte en el desarrollo dentario. Estudios recientes demuestran que la amelogenina se expresa en los condrocitos. Las proteínas de membrana asociadas a lisosomas (LAMPs) se han identificado como proteínas de unión asociadas a la amelogenina; se ha sugerido que actúan como receptores de señalización de la amelogenina. El propósito de este estudio fue aclarar la localización de la amelogenina y las LAMPs en el cartílago de crecimiento y nódulos cartilaginosos en cultivos de micromasa. Articulaciones de la rodilla del ratón, que incluían la placa de crecimiento tibial de 4 semanas de edad y cultivos de micromasa de células mesenquimales del brote del miembro después de 2 semanas se fijaron en paraformaldehído y procesaron rutinariamente. Los cortes fueron sometidos a inmunotinción con amelogenina, colágeno tipo II y X, LAMP-1 y LAMP-3 . Se observó inmunorreacción positiva de amelogenina tanto en la zona proliferación e hipertrófica del cartílago de crecimiento después del pretratamiento enzimático. Además, los nódulos cartilaginosos en el cultivo de micromasa eran inmunopositivos para la amelogenina. Los condrocitos en la zona de proliferación de la placa de crecimiento fueron immunopositivos a LAMP-1, mientras que los condrocitos de la zona hipertrófica se tiñeron débilmente. Estas observaciones indican que la amelogenina puede estar presente en la matriz del cartílago producida tanto in vivo e in vitro, además la amelogenina puede estar implicada en la formación de cartílago mediante la vía de señalización de LAMP-1.
Asunto(s)
Animales , Ratones , Proteínas de Membrana de los Lisosomas/metabolismo , Amelogenina/metabolismo , Coloración y Etiquetado , Inmunohistoquímica , Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcriptasa Inversa , Condrogénesis , Proteínas de Membrana de los Lisosomas/genética , Ratones Endogámicos C57BLRESUMEN
Durante el desarrollo embriológico las extremidades surgen de la condensaciónde células mesenquimales y su diferenciación a condrocitos en un proceso llamado condrogénesis. Estos condrocitos sintetizanglicosaminoglicanos, jugando un papel importante durante este proceso. Existe un sistema de condrogénesis in vitro utilizandocélulas mesenquimales generalmente evaluado mediante histoquímica. Objetivo. Establecer un sistema de puntaje semi-automáticopara ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos. Materiales y métodos. Para condrogénesis las células fueron cultivadas conmedio inductor en agregados por tres semanas. Los glicosaminoglicanos totales fueron determinados mediante azul de dimetileno.Para el análisis histológico los agregados fueron teñidos con azul de alcian e inmunohistoquímica para detección de agrecán. Lapuntuación semi-automática fue obtenida utilizando el programa ImageJ. Resultados. Las células mesenquimales cultivadas enmedio de diferenciación condrogénica tuvieron una concentración de proteína comparable durante las tres semanas de cultivo,sugiriendo una celularidad similar. La concentración de glicosaminoglicanos fue superior para los agregados cultivados en mediocondrogénico. La misma tendencia fue observada para la tinción de azul de alcian mediante puntajes del observador ciego y análisiscon ImageJ. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica de puntajes asignados por el observador y los del análisis porImageJ revelaron una tendencia decreciente con el tiempo para agregados en medio condrogénico. Conclusión. Desarrollamos un sistema funcional para generación de puntaje semi-automático para diferenciación condrogénica. Corroboramos estos resultadosmediante análisis bioquímico con resultados comparables. En nuestro saber este es el primer reporte en evaluar esta metodología,la cual puede ser útil para otras aplicaciones en el campo biológico o médico...
During embryological limb formation mesenchymal cells condense and differentiate into chondrocytes, in a process known aschondrogenesis. These chondrocytes synthesize glycosaminoglycans (GAGs), thus playing an important role in this process.A simplified system in vitro chondrogenesis, using adult mesenchymal stromal cells (MSCs) has been demonstrated. Thisdifferentiation potential is usually assessed by histological staining. Objective. Establishment of a semi-automatic grading systemfor histochemistry stains and immunohistochemistry assays. Materials and methods. For chondrogenesis cells were culturedfor three weeks in aggregates with inducing media. Total GAGs were measured using dimethylmethylene blue (DMB) method.For histological analyses aggregates were stained with Alcian blue for total GAGs detection and immunohistochemistry (IHC)for aggrecan was performed. Semi-automatic grading for all slides was obtained after ImageJ analysis. Results. MSCs culturedas aggregates in chondrogenic differentiation media had similar protein concentrations for all time points, suggesting cellularityremained homogenous during culture. Total GAGs was higher for aggregates cultured in chondrogenic compared to complete media.The same trend was observed for Alcian blue stain grades by blinded observer and analysis using ImageJ software. Aggrecans IHCanalysis had a decreasing tendency with time for aggregates in chondrogenic media for blinded observer and ImageJ evaluation.Conclusion. We developed a functional system for semi-automatic slide grading. We corroborated these results by biochemicalanalysis with comparable results. To our knowledge, for in vitro chondrogenesis, this is the first report to evaluate stains usingthis methodology. This procedure might be useful for other applications in the field of Biology and Medical Sciences...
Durante o desenvolvimento embrionário os membros emergem a partir da condensação decélulas mesenquimais e sua diferenciação em condrócitos em um processo chamado condrogênese. Estes condrócitos sintetizamglicosaminoglicanos, desempenhando um papel importante neste processo. Existe um sistema de condrogénese in vitro utilizandocélulas mesenquimatosas, geralmente avaliado por histoquímica. Objetivo. Estabelecer um sistema de pontuação semi-automáticopara ensaios histoquímicos e imuno-histoquímicos. Materiais e métodos. Na condrogênese as células foram cultivadas commeio indutor em agregados, durante três semanas. Os glicosaminoglicanos totais foram determinados pelo azul de dimetileno.Para a análise histológica os agregados foram corados com Azul Alciano e imuno-histoquímica para detecção de agrecan. Apontuação semi-automática foi obtida utilizando o programa ImageJ. Resultados. As células mesenquimais cultivadas em meiode diferenciação condrogênica tiveram uma concentração de proteína comparável durante as três semanas de cultura, o que sugereuma celularidade similar. A concentração de glicosaminoglicanos foi maior para os agregados cultivados em meio condrogênico.A mesma tendência foi observada para a coloração com Azul Alciano segundo as pontuações do observador cego e a análisecom ImageJ. Finalmente, os resultados de imuno-histoquímica de pontuações dados pelo observador e aqueles dados pela análiseImageJ revelaram uma tendência decrescente ao longo do tempo para os agregados em meio condrogênico. Conclusão. Nósrealizamos um sistema funcional para gerar pontuação semi-automática para diferenciação condrogênica. Nós corroboramos essesresultados por análise bioquímica com resultados comparáveis. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliaresta metodologia, que pode ser útil para outras aplicações no campo biológico ou médico...