Avaliação laboratorial da doença residual mínima na leucemia mielóide crônica por Real-Time PCR: [revisão] / Evaluation diagnosis of minimal residual disease in chronic myeloid leukemia by Real-Time PCR: [review]

A leucemia mielóide crônica (LMC) representa 15 por cento das leucemias e apresenta três fases: crônica, acelerada e crise blástica. A partir da análise citogenética, pode ser identificado o cromossomo Philadelphia, característico da LMC. O transplante de células-tronco é o único tratamento curativo, mas é acompanhado de altas taxas de morbimortalidade, dificultando sua aplicação. A doença residual mínima é de grande importância para avaliar a resposta ao tratamento, tanto na verificação de doença residual, quanto na identificação de pacientes com alto risco de recaída. Muitas técnicas específicas têm sido introduzidas para detectar as translocações ou os produtos do cromossomo Philadelphia. A mais sensível é a Real-Time PCR, que detecta uma célula leucêmica em 10(5) células normais. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica sobre a LMC, dando ênfase à utilização da técnica por Real-Time PCR.

Chronic myeloid leukemia (CML) represents about 15 percent of all leukemias and has three phases: the chronic phase, accelerated phase and blast crisis. After cytogenetic analysis, the Philadelphia chromosome, characteristic of CML, can be identificated. Stem cell transplantation is the only curative treatment for CML, but it is accompanied by high levels of morbimortality, difficulting its application. The minimal residual disease is very important for the evaluation of the response to treatment, to verify the residual disease and also to identify patients with a high risk of relapse. Many specific techniques have been introduced for the detection of translocations or products of the Philadelphia chromosome; the most sensitive being Real-Time PCR which detects 1 leukemia cell in 10(5) normal cells. The aim of this study was to perform a bibliographic review of CML, with emphasis on the utilization of the Real-Time PCR technique.

Simplified flow cytometric assay to detect minimal residual disease in childhood with acute lymphoblastic leukemia / Detecção de doença residual mínima em crianças com leucemia linfoblástica aguda por citometria de fluxo

The detection of minimal residual disease (MRD) is an important prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) providing crucial information on the response to treatment and risk of relapse. However, the high cost of these techniques restricts their use in countries with limited resources. Thus, we prospectively studied the use of flow cytometry (FC) with a simplified 3-color assay and a limited antibody panel to detect MRD in the bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) of children with ALL. BM and PB samples from 40 children with ALL were analyzed on days (d) 14 and 28 during induction and in weeks 24-30 of maintenance therapy. Detectable MRD was defined as > 0.01 percent cells expressing the aberrant immunophenotype as characterized at diagnosis among total events in the sample. A total of 87 percent of the patients had an aberrant immunophenotype at diagnosis. On d14, 56 percent of the BM and 43 percent of the PB samples had detectable MRD. On d28, this decreased to 45 percent and 31 percent, respectively. The percentage of cells with the aberrant phenotype was similar in both BM and PB in T-ALL but about 10 times higher in the BM of patients with B-cell-precursor ALL. Moreover, MRD was detected in the BM of patients in complete morphological remission (44 percent on d14 and 39 percent on d28). MRD was not significantly associated to gender, age, initial white blood cell count or cell lineage. This FC assay is feasible, affordable and readily applicable to detect MRD in centers with limited resources.

A detecção de doença residual mínima (DRM) é um importante fator prognóstico na leucemia linfóide aguda (LLA) infantil e fornece informações sobre a resposta ao tratamento e o risco de recaída. Entretanto, os altos custos das técnicas utilizadas limitam seu uso nos países em desenvolvimento. Desta forma, realizamos um estudo prospectivo para avaliar a citometria de fluxo (CF), utilizando três fluorescências e um painel limitado de anticorpos monoclonais, como método de detecção de DRM em medula óssea (MO) e sangue periférico (SP) de crianças com LLA. Amostras de MO e SP de 40 crianças portadoras de LLA foram analisadas nos dias (d)14 e d28 da indução e nas semanas 24-30 da terapia de manutenção. Foram consideradas como DRM+ as amostras que apresentaram > 0,01 por cento das células com o fenótipo aberrante (FA). Oitenta e sete por cento dos pacientes apresentaram FA ao diagnóstico. No d14, 56 por cento das amostras de MO e 43 por cento do SP apresentaram DRM. No d28, foi detectada DRM em 45 por cento e 31 por cento das amostras de MO e SP, respectivamente. A porcentagem de DRM na MO foi similar à do SP nos casos de LLA-T, mas aproximadamente dez vezes maior na LLA de precursor-B. Foi detectada DRM na MO de 44 por cento e 39 por cento dos pacientes que estavam remissão morfológica nos d14 e d28, respectivamente. Não foi demonstrada associação significante entre a presença de DRM e sexo, idade, leucometria inicial e linhagem celular. Esta técnica de detecção de DRM por CF é relativamente barata e pode ser aplicada em centros com recursos limitados.

Donor lymphocyte infusions for the treatment of minimal residual disease in acute leukemia / Infusão de linfócitos do doador para o tratamento da doença residual mínima

Minimal residual disease (MRD) was monitored in 80 patients with acute lymphoid (ALL, n=44) or myeloid (AML, n=36) leukemia, undergoing allogeneic haemopoietic stem cell transplantations. MRD markers were IgH-VDJ and TCR gene re-arrangement for ALL, and Wilm's Tumor (WT1) expression for AML. The overall cumulative incidence (CI) of MRD was positive in 45 percent and the CI of hematologic relapse was 24 percent (36 percent in MRD+ vs. 16 percent in MRD patients, p=0.03). The median interval from transplant to first MRD positivity was 120 days and to hematologic relapse 203 days. Patients were divided in 3 MRD groups: MRD (n=44), MRD+ given donor lymphocyte infusions (DLI) (n=17) and MRD+ not given DLI (n=19): leukemia relapse rates in these 3 groups were 16 percent, 6 percent and 63 percent, respectively (p<0.0001); the actuarial 3-year survival rates were 78 percent, 80 percent and 26 percent (p=0.001). In multivariate COX analysis, the MRD group was predictor of relapse (p<0.0001) and survival (p=0.01), together with disease phase and chronic graft versus host disease. In MRD+ patients, DLI protected against relapse (p=0.003) and improved survival (p=0.01). In conclusion, MRD positivity post-transplant predicts leukemia relapse: however, when MRD+ patients are given DLI, their outcomes are comparable to MRD- patients.

A doença residual mínima (DRM) foi monitorada em 80 pacientes com leucemia linfóide aguda (n=44) e mielóide aguda (n=36) que foram submetidos ao transplante alogênico de célula-tronco. Marcadores da DRM foram a IgH-VDJ e rearranjo do TCR para a LLA e expressão do Tumor de Wills (WT1) para LMA. A incidência acumulada global (IC) para a DRM foi positiva em 45 por cento e a IC para recaída hematológica foi 24 por cento (36 por cento na DRM+ versus 16 por cento na DRM-, p=0.03). O intervalo mediano entre o TMO e a primeira DRM positividade foi dia +120, e para a recaída hematológica, dia +203. Os pacientes puderam ser divididos em três grupos: DRM-(n=44), DRM+ onde foi dada a infusão de linfócitos do doador (ILD) (n=17) e DRM+ não dado ILD (n=19): a recidiva nos três grupos foi de 16 por cento, 6 por cento e 63 por cento, respectivamente (p<0.0001); a sobrevida em três anos foi 78 por cento, 80 por cento e 26 por cento (p=0.001). No modelo de Cox, o grupo de DRM foi preditor de recidiva (p<0.0001) e sobrevida global (p=0.01), juntamente com a fase da doença e a doença do enxerto contra o hospedeiro. Na DRM+, IDL protegeu contra a recidiva (p=0.003) e melhorou a sobrevida (p=0.01). Em conclusão, a positividade para a DRM pós-transplante prediz recidiva da leucemia. Entretanto, quando é dada a ILD ao paciente DRM+, a evolução destes pacientes é comparável aos pacientes DRM-.

Monitoramento de doença residual mínima em leucemia mielóide crônica por PCR em tempo real: [revisão] / Monitoring minimal residual disease in chronic myeloid leukemia by real time PCR: [review]

O monitoramento de doença residual mínima (DRM) em leucemia mielóide crônica é extremamente importante, pois possibilita o diagnóstico precoce de eventuais recidivas da doença. Este estudo visa apresentar uma revisão bibliográfica sobre a aplicação e a avaliação da eficácia do método de PCR em tempo real no monitoramento da doença residual mínima em pacientes com leucemia mielóide crônica. O método fornece informações a respeito do número e cinética das células tumorais residuais, sendo atualmente o padrão ouro para seu monitoramento. O uso de transcrição reversa associada à PCR em tempo real tornou a quantificação de mRNA mais simples e precisa. A metodologia mais utilizada é a TaqMan, que emprega a atividade exonucleásica 5'-3' da Taq DNA Polimerase. O monitoramento da DRM é feito após transplante de medula óssea ou após terapias baseadas em drogas, como o interferon-a e o mesilato de imatinibe. Entretanto, os estudos sobre o assunto apresentam os dados de maneiras conflitantes, dificultando a interpretação e comparação dos resultados. A determinação e uniformização dos cut-offs em diversas condições se fazem necessárias a fim de que a metodologia de PCR em tempo real seja aplicada na clínica.

Monitoring minimal residual disease (MRD) in chronic myeloid leukemia is a very important issue, because it makes early diagnosis of relapse of the disease possible. The objective of this study is to present a review on the use and evaluation of real time PCR in monitoring minimal residual disease in patients with chronic myeloid leukemia. The method provides information on the number and kinetics of tumour residual cells which currently it is the gold standard for monitoring MRD. The use of reverse transcription associated to real time PCR has made the quantification of mRNA easier and more accurate. TaqMan methodology, that exploits the 5'-3' exonuclesase activity of Taq DNA Polymerase, is the most common method used for this purpose. Monitoring MRD is required after stem cell transplantation and after drug-based therapies including Interferon-a and Imatinib Mesylate. So far, the studies published on this issue present differing and conflicting data, making the interpretation and comparison of the results very difficult. In order to use real time PCR to monitor MRD in chronic myeloid leukemia patients it is necessary to determine and to standardize cut-off points for results obtained under different conditions. This procedure will certainly be helpful for better clinical decision making.

O valor da imunofenotipagem para o diagnóstico do Mieloma Múltiplo e na avaliação da doença residual mínima / The value of immunofenotyping for the diagnosis of Multiple Myeloma and for the evaluation of minimal residual disease

Os plasmócitos normais podem ser diferenciados dos presentes no mieloma múltiplo por imunofenotipagem. Os normais são CD45+, CD19+, CD20+, CD38++, CD56-/fraco, CD138+, mIg-, cIg policlonal. Por outro lado, os plasmócitos do mieloma múltiplo são monoclonais (cIg) e aproximadamente 80 por cento são CD19-CD56+ e 20 por cento CD19-CD56-. O perfil na leucemia plasmocitßria primßria é semelhante ao do mieloma, embora a positividade para o CD56 ocorra em 45 por cento dos casos. Na gamopatia monoclonal de causa indeterminada existe uma mistura de plasmócitos normais e neoplßsicos, que têm perfil semelhante ao do mieloma múltiplo. A doença residual na medula é importante para estimar a resposta terapêutica e pode ser avaliada por citometria de fluxo e pela reação da polimerase em cadeia para o rearranjo da cadeia pesada da Ig. A citometria apresenta sensibilidade de 10-4 a 10-5, é realizada em aproximadamente duas horas e a sua aplicabilidade chega a 90 por cento. O PCR qualitativo tem sensibilidade de 10-6 enquanto o quantitativo, 10-5. Em ambos, o tempo para a realização é maior (2-3 dias), com aplicabilidade de 75 por cento.

Normal plasma cells can be differentiated from multiple myeloma by their immunophenotype. Normal cells are CD45+, CD19+, CD20+, CD38++, CD56-/dim, CD138+, mIg- and polyclonal cIg. On the other hand, with multiple myeloma, plasma cells are monoclonal (cIg) and approximately 80 percent are CD19- CD56+ and 20 percent CD19- CD56-. The profile in plasma cell leukemia is similar to myeloma, but the CD56 is positive in 45 percent of cases. In the monoclonal gammopathy of undetermined significance there is a mixture of normal and neoplastic plasma cells. Residual disease in bone marrow is important to determine the efficacy of treatment and can be evaluated by flow cytometry or polymerase chain reaction of rearranged heavy chains of Ig. Flow cytometry has a sensitivity of 10-4 to 10-5, is performed in 2-3 hours and is applicable in 90 percent of cases. Qualitative PCR has a sensitivity of 10-6 and quantitative PCR of 10-5. Both tests are performed in 2-3 days and their applicability is around 75 percent.

O estudo da doença residual mínima em câncer de mama / The study of minimal residual disease in breast cancer patients

O termo doença residual mínima (DRM) ou micrometástase refere-se à presença de algumas células tumorais nos tecidos normais não factíveis de serem detectáveis por meio de metodologias propedêuticas convencionais como o exame clínico, métodos de imagem ou análises laboratoriais de rotina. A pesquisa de DRM em pacientes com câncer de mama se faz atualmente através da avaliação da medula óssea ou sangue periférico para a presença de células epiteliais por técnicas de imunocitoquímica ou moleculares como o Rt-PCR. Estudos citogenéticos e moleculares demonstraram que estas células albergam também alterações cromossômicas semelhantes aos tumores presentes nos pacientes e sua consistente associação com um pior prognóstico em pacientes com câncer de mama reforçam sua importância para o processo metastático. Discutiremos sumariamente, a seguir, as bases técnicas da detecção da DRM e os estudos recentes que nos permitiram conhecer algumas das características moleculares e celulares destas células malignas disseminadas. Finalizaremos este artigo com uma discussão dos trabalhos mais recentes acerca do valor prognóstico da detecção da DRM em pacientes com câncer de mama e as futuras direções da pesquisa nesta área.

Minimal residual disease (MRD) or micrometastasis refers to the presence of tumor cells in normal tissues not amenable to be detected by physical examination, laboratory tests or imaging techniques in current clinical use. The search for MRD in patients with breast cancer is currently conducted through the evaluation of the bone marrow or peripheral blood for the presence of epithelial cells by immunocytochemical or molecular techniques such as RT-PCR. Recent cytogenetical and molecular studies revealed that these cells carry chromossomal abnormalities similar to the primary tumors from which they originated and their consistent association with a wose prognosis in the patients in whom they are detectable reinforces their importance in the metastatic process. We will discuss briefly the technical aspects of the detection of MRD and the studies that evaluated the molecular and cellular characteristics of these disseminated malignant cells. We will then discuss recent work relating to the prognostic implications of MRD in breast cancer patients and the future directions of this research area.

Genes de imunoglobulina, doença residual mínima e origem dos linfomas não-Hodgkin B / Immunoglobulin genes, minimum residual disease and the origin of non-Hodgkin B lymphomas

Neste relato são apresentados aspectos báisicos dos genes de imunoglobulina, da origem dos linfomas não-Hodgkin B e doença residual mínima. É descrito como os conhecimentos de biologia molecular de uma doença podem afetar o diagnóstico e acompanhamento de resposta terapêutica.

Basic aspects relating to the imunoglohuline genes, the origin of non-Hodgkin B lymphomas, and minimum residual disease are related in this work.How knowledge of the disease using molecular biology can affect the diagnosis and the therapeutical response are also described.