Anti HCV activity and expression inhibition of HCC markers by protein extract from Iberis gibraltarica / Atividade anti-HCV e inibição da expressão de marcadores HCC por extrato de proteína de Iberis gibraltarica

Hepatitis C virus infection (HCV) is the foremost reason of progressive hepatic fibrosis and cirrhosis, with an elevated risk of hepatocellular carcinoma (HCC) development. Medicinal plants have been used for human health benefits for several years, but their therapeutic potential needs to be explored. The main objective of this study was to figure out the in vitro antiviral and anticancer characteristics of total crude protein of Iberis gibraltarica against HCV and HCC. Total crude protein of Iberis gibraltarica was isolated and quantified. The level of cytotoxicity was measured against the HepG2 cell line and it shows no significant cytotoxicity at the concentration of 504µg/ml. The anti-HCV effect was determined by absolute quantification via real time RT-PCR method and viral titer was reduced up to 66% in a dose dependent manner against the total protein of Iberis gibraltarica. The anticancer potential of Iberis gibraltarica was also examined through mRNA expression studies of AFP and GPC3 genes against the total protein of Iberis gibraltarica-treated HepG2 cells. The results show up to 90% of the down-regulation expression of AFP and GPC3. The obtained results indicate the therapeutic potential of total protein of Iberis gibraltarica against HCV and hepatocellular carcinoma in vitro.

A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é a principal causa de fibrose hepática progressiva e cirrose, com risco elevado de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (HCC). As plantas medicinais vêm sendo utilizadas para benefícios à saúde humana há vários anos, mas seu potencial terapêutico precisa ser explorado. O principal objetivo deste estudo foi descobrir as características antivirais e anticancerígenas in vitro da proteína bruta total de Iberis gibraltarica contra HCV e HCC. A proteína bruta total de Iberis gibraltarica foi isolada e quantificada. O nível de citotoxicidade foi medido contra a linha celular HepG2 e não apresenta citotoxicidade significativa na concentração de 504µg/ml. O efeito anti-HCV foi determinado por quantificação absoluta através do método RT-PCR em tempo real e o título viral foi reduzido em até 66% de forma dose-dependente contra a proteína total de Iberis gibraltarica. O potencial anticancerígeno de Iberis gibraltarica também foi examinado através de estudos de expressão de mRNA dos genes AFP e GPC3 contra a proteína total de células HepG2 tratadas com Iberis gibraltarica. Os resultados mostram até 90% da expressão de regulação negativa de AFP e GPC3. Os resultados obtidos indicam o potencial terapêutico da proteína total de Iberis gibraltarica contra HCV e carcinoma hepatocelular in vitro.

In silico and in vitro evaluation of primers for molecular differentiation of Leishmania species / Avaliação in silico e in vitro de iniciadores para a diferenciação molecular de espécies de Leishmania

Abstract Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by over 20 species of protozoan parasites of the genus Leishmania. Infection is commonly spread by sandflies and produces a wide spectrum of clinical signs and symptoms. Therefore, from an epidemiological and therapeutic standpoint, it is important to detect and differentiate Leishmania spp. The objective of this study was to combinate in silico and in vitro strategies to evaluate the analytical specificity of primers previously described in the literature. According to electronic PCR (e-PCR) analysis, 23 out of 141 pairs of primers selected through literature search matched their previously reported analytical specificity. In vitro evaluation of nine of these primer pairs by quantitative PCR (qPCR) confirmed the analytical specificity of five of them at the level of Leishmania spp., L. mexicana complex or Leishmania and Viannia subgenera. Based on these findings, the combination of e-PCR and qPCR is suggested to be a valuable approach to maximize the specificity of new primer pairs for the laboratory diagnosis of infections with Leishmania spp.

Resumo As leishmanioses são zoonoses causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania. As infecções são comumente disseminadas por flebotomíneos e causam um amplo espectro de manifestações clínicas. Portanto, a detecção e diferenciação de espécies de Leishmania são importantes do ponto de vista epidemiológico e terapêutico. O objetivo deste estudo foi combinar estratégias in silico e in vitro para avaliar a especificidade analítica dos primers descritos anteriormente na literatura. De acordo com a PCR eletrônica (e-PCR), 23 dos 141 pares de primers selecionados por meio de pesquisa da literatura estavam de acordo com a especificidade analítica anteriormente relatada. A avaliação in vitro de nove desses pares de primers, por PCR quantitativa (qPCR), confirmou a especificidade analítica de cinco deles ao nível de espécie de Leishmania, do complexo L. mexicana ou dos subgêneros Leishmania e Viannia. Com base nos resultados, sugere-se que a combinação de e-PCR e qPCR é uma abordagem valiosa para a validação e maximização da especificidade de novos pares de primers para o diagnóstico laboratorial de infecções com Leishmania spp.

Análise Temporal dos Transcritos dos Genes bdnf e ntrk2 em Cérebro de Zebrafish Induzido à Crise Epiléptica por Pentilenotetrazol / Temporal transcript profile of bdnf, ntrk2a and ntrk2b genes in zebrafish brain after Pentylenotetrazole (PTZ)-induced seizure

Objetivo: Investigar o perfil temporal de transcritos dos genes bdnf, ntrk2a e ntrk2b em cérebro de zebrafish após crise epiléptica induzida por Pentilenotetrazol (PTZ). Metodologia: Os animais foram divididos em Grupo PTZ (induzidos à crise epiléptica com PTZ 15mM) e Grupo Controle (animais sem crise epiléptica) e seus cérebros coletados nos tempos: 0h, 12h, 24h, 48h, 72h pós-crise. Reações de transcriptase reversa-PCR quantitativa foram realizadas com os controles endógenos 18s e ef1a usando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems, Foster City). A quantificação relativa foi calculada pela equação QR=2–∆∆CT e a significância estatística dada pelo teste Kruskall-Wallis (p≤0,05). Resultados: No grupo PTZ houve um aumento significativo dos niveis de RNAm do gene bdnf no tempo 0h (p=0,017). O aumento de transcritos encontrado nos outros tempos não foi significante (p>0,05). Conclusão: Nossos resultados mostraram que a indução de crise epiléptica alterou o padrão de transcrito do gene bdnf no cérebro do zebrafish como visto em outros modelos animais e em humanos, porém em um padrão temporal diferente. Este é o primeiro estudo que descreve o perfil temporal de transcritos bdnf/ntrk2 em cérebro de zebrafish após crise epiléptica e contribui para a caracterização deste pequeno peixe como modelo de estudo em epilepsias.

Objective: The main aim of this study was to investigate the transcript profile of bdnf, ntrk2a and ntrk2b genes in adult zebrafish brain after Pentylenotetrazole (PTZ)-induced seizure. Methods: Zebrafish were separated in PTZ (seizure-induced) and Control (no seizure) groups. At 0h, 12h, 24h, 48h and 72h after seizure, animals were anesthetized and their brains were immediately collected for RNA extraction. Reverse transcriptase quantitativePCRs were carried out with 18S and ef1a as endogenous control using TaqManTM System (Applied Biosystems, Foster City). The relative quantification was calculated by the equation RQ=2–∆∆CT. Statistical analysis was performed by Kruskall-Wallis test (p≤0.05). Results: Comparisons between both groups showed an increase of bdnf mRNA levels in the PTZ group at 0h after seizure (p= 0.017). No statistical significance was found in other times investigated (p>0.05). Conclusions: Our results showed an up-regulation of the transcript levels of bdnf gene in zebrafish brain after seizure as seems in other models and humans, but in a different pattern. This is the first study investigating temporal pattern of bdnf, ntrk2a and ntrk2b genes in zebrafish brain after a seizure and contributes to characterize it as a model for epilepsy studies.