RESUMEN
Abstract Production of lignocellulolytic enzymes by filamentous fungi have a great potential at industrial level due to their widespread applications. Mixed fungal cultures and particularly mixed fungal biofilms constitute a promising fermentation system for an enhanced enzyme production. However, it has not been addressed how much of this enhancement depends on the mixed biomass proportion. In this sense, the aim of this study was to develop a method to specifically and accurately quantify mixed fungal biomass. For this purpose, mixed biofilm cultures composed of Aspergillus niger and Trichoderma reesei, two filamentous fungi used industrially for cellulase production, were collected from 48 to 120 h of growth; mycelia were pulverized, and DNA was extracted for qPCR assays with specific primers for each fungus. Primers were designed from non-conserved regions of sequences of actin and β-tubulin genes of both A. niger and T. reesei. Specificity of these primers was tested in silico and experimentally. A statistically significant correlation was obtained between qPCR-calculated biomass and dry weight biomass data. By this method, it was possible to detect changes on mycelia proportions in biofilms over time, suggesting a competitive interaction between these two fungi. In conclusion, this method allows a specific and accurate quantification of mixed fungal biomass and could be also applied to different mixed culture systems for studying microbial interactions.
Resumen La producción de enzimas lignocelulolíticas por hongos filamentosos tiene un gran potencial a nivel industrial debido a sus diversas aplicaciones. Los cultivos fúngicos mixtos y particularmente las biopelículas fúngicas mixtas constituyen un sistema de fermentación prometedor para una mayor producción enzimática. Sin embargo, no se ha abordado cuánto de esta mejora depende de la proporción de biomasa mixta. En este sentido, el objetivo de este estudio fue desarrollar un método para cuantificar de forma específica y precisa la biomasa fúngica mixta. Para este propósito, se recolectaron cultivos mixtos de biopelículas de 48 a 120 h de crecimiento compuestos por Aspergillus niger y Trichoderma reesei, dos hongos filamentosos utilizados industrialmente para la producción de celulasas; el micelio se pulverizó y el ADN se extrajo para ensayos de qPCR con cebadores específicos para cada hongo. Los cebadores se diseñaron a partir de regiones no conservadas de las secuencias de los genes de actina y β-tubulina de A. niger y T. reesei. La especificidad de estos cebadores se probó in silico y experimentalmente. Se obtuvo una correlación estadísticamente significativa entre la biomasa calculada mediante qPCR y los datos de biomasa en peso seco. Mediante este método, fue posible detectar cambios en las proporciones de los micelios en las biopelículas a lo largo del tiempo, lo que sugiere una interacción competitiva entre estos dos hongos. En conclusión, este método permite una cuantificación específica y precisa de la biomasa fúngica mixta y también podría aplicarse a diferentes sistemas de cultivo mixto para estudiar interacciones microbianas.
RESUMEN
Floriculture is a vital agro-industrial sector in the Colombian economy; the export of flowers positively impacts employment and the balance of trade. However, this industry could negatively impact the environment if its waste products are not handled properly. These flower residues, rich in lignin, hemicellulose and cellulose, could be a cost-effective raw material to produce enzymes. Here, we evaluate the production of lignocellulolytic enzymes by degradation of Chrysanthemum and Rosa residues using Pleurotus ostreatus, and manganese sulfate and copper sulfate as inductors. From the two residues, we obtained laccase, manganese peroxidase, endoglucanase, exoglucanase, and (3-glucosidase. The use of inductors, favored all enzyme activities except for (3-glucosidase. The enzymes that displayed the highest activity were laccase (4,693.4 U/L and 2,640 U/L from the residues of Chrysanthemum and Rosa, respectively) and (3-glucosidase (9,513 U/L and 6,811.9 U/L). The enzyme that showed the lowest activity was endoglucanase (11.5 U/L and 15.4 U/L). Under the conditions evaluated, the best substrate for enzyme production is Chrysanthemum wastes; the extracts obtained had higher enzymatic activity than the extracts from Rosa residues.
En Colombia la floricultura es un sector agro-industrial importante, con impactos positivos en el empleo y la balanza comercial. Sin embargo, tiene impacto negativo en el medio ambiente porque genera alto volumen de residuos. Estos residuos, ricos en lignina, hemicelulosa y celulosa, podrían ser una materia prima de bajo costo para la producción de enzimas. En este trabajo se estudió en la producción de enzimas lignocelulíticas por la degradación con Pleurotus ostreatus de residuos de Chrysanthemum y Rosa, usando como inductores sulfato de manganeso y de cobre. A partir de ambos residuos se obtuvieron lacasa, manganeso peroxidasa, endoglucanasa, exoglucanasa y p-glucosidasa. Los inductores favorecieron todas las actividades enzimáticas, excepto para p-glucosidasa. Las enzimas que tuvieron mayores actividades fueron lacasa (4,693.4 U/L y 2,640 U/L a partir del residuo de Chrysanthemum y Rosa, respectivamente) y p-glucosidasa (9,513 U/L y 6,811.9 U/L). La enzima que tuvo menor actividad fue endoglucanasa (11.5 U/L y 15.4 U/L). Bajo las condiciones evaluadas, el mejor residuo para producción de enzimas fue Chrysanthemum, porque los extractos tuvieron mayor actividad enzimática que los producidos a partir de Rosa.
Na Colombia, a floricultura è um importante setor da indùstria agrícola, com impactos positivos sobre o sector laboral na balança comercial. Além disto, tem impacto negativo sobre o meio ambiente, pois gera grandes volumes de resíduos. Estes resíduos, com altos conteùdos em lignina, hemicelulose e celulose, podem ser uma matèria-prima de baixo custo para a produçâo de enzimas. Neste traballio foi estudada a produçâo da enzimas lignoceluliticas pela degradaçâo com Pleurotus ostreatus de residuos de Chrysanthemum e Rosa, utilizando como indutores sulfatos de cobre e manganês. A partir destes resíduos foram obtidos lacase, manganês peroxidase, endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase. O uso de indutores favoreceu as atividades enzimáticas, exceto β-glicosidase. As enzimas que apresentaram atividades mais elevadas foram lacase (4,693.4 U/L e 2,640 U/L a partir do Chrysanthemum e Rosa, respetivamente) e β-glicosidase (9,513 U/L e 6,81.9 U/L). A enzima que apresentou menor atividade foi a endoglucanase (11.5 U/L e 15.4 U/L). Nas condiçôes testadas, o melhor resíduo para a produçâo da enzima foi Chrysanthemum, porque os extratos tinham uma atividade enzimática mais elevada que aqueles produzidos a partir de Rosa.