Streptococcus agalactiae - Distribuição sorotípica e relação com fatores de virulência e resistência antimicrobiana / Streptococcus agalactiae - Serotype distriburion and correlation with virulence factors and antibiotic resistance

Streptococcus agalactiae, ou Estreptococo do Grupo B, é um microrganismo que encontrado na microbiota intestinal, vaginal e/ou geniturinária de 10-30% de mulheres saudáveis. A principal infecção causada por S. agalactiae é a sepse neonatal. O bebê pode adquirir o microrganismo durante o parto ao passar pelo canal vaginal, ou até mesmo durante a gestação, caso haja ascensão de S. agalactiae para o útero. Existem diversos fatores associados à infecção do feto por S. agalactiae quando a mãe é colonizada, tais como fator CAMP, cápsula de polissacarídeos, hialuronidase, ß-citolisina/hemolisina e pili. Não existe consenso ou recomendação técnica sobre o tema no Brasil. Segundo o Caderno de Atenção Básica ao Pré-Natal, não existem estudos que levem à recomendação da antibioticoterapia intraparto. É necessário elucidar as características genotípicas de cepas de S. agalactiae isoladas no Brasil para alinhar as práticas clínicas às características fenotípicas do microrganismo. Desta forma, os objetivos deste projeto são: i) classificar cepas de S. agalactiae isoladas de gestantes e não gestantes quanto ao sorotipo capsular, por PCR Multiplex, ii) avaliar a presença e distribuição de fatores de virulência, por PCR e iii) avaliar o perfil de resistência antimicrobiana, pelo método de disco difusão e teste D. Os achados de virulência e resistência a antimicrobianos foram comparados com os sorotipos, gestação, localização geográfica e sítio de isolamento. Foram analisadas 292 cepas isoladas de gestantes e não gestantes em São Paulo, São José dos Campos e Rio de Janeiro. O sorotipo Ia foi o mais prevalente entre as cepas. Na cidade de São José dos Campos não houve diferença significativa entre a prevalência dos sorotipos Ia e V, sendo que o sorotipo V foi mais abundante do que nas cidades de São Paulo e Rio de Janeiro. O sorotipo II foi mais abundante em mulheres não gestantes do que gestantes. Não foram encontradas cepas resistentes à Penicilina e vancomicina; contudo a resistência a Cefepima, Eritromicina e Clindamicina ficou em torno de 22%. Foram encontradas diferenças entre os sorotipos quanto à resistência, genes de virulência e sítio de isolamento das cepas. Portanto essas diferenças podem se refletir no perfil epidemiológico da infecção por S. agalactiae quanto à localização geográfica também quanto à gestação. A incidência de sepse causada por S. agalactiae diminuiu muito nas últimas décadas, contudo o monitoramento constante é necessário para alinhar as práticas clínicas às características fenotípicas do microrganismo

Streptococcus agalactiae, or Group B Streptococcus, is a microorganism found in intestinal, vaginal and/or genitourinary microbiota from about 10-30% of all healthy women. The main infection caused by S. agalactiae is neonatal sepsis. The baby can contract the infection during labor when passing through the vaginal canal, or even during pregnancy, if S. agalactiae ascends from the vaginal canal to the uterus. There are several factors associated to the infection of the fetus by S. agalactiae when the mother is colonized, such as the CAMP factor, polysaccharide capsule, hyaluronidase, ß-cytolysin/hemolysin and pili. There is no consensus or technical recommendation regarding this theme in Brazil. According to the Brazilian guidelines to prenatal care, there is no research that justifies the implementation of intrapartum antibiotic therapy. There is a need to clarify genotype characteristics of S. agalactiae strains isolated in Brazil in order to align clinical practices to phenotypical characteristics of this microorganism. This way, the goals of this project are: i) to classify S. agalactiae strains isolated from pregnant and nonpregnant women according to their capsular serotype, using PCR Multiplex, ii) to evaluate the presence and distribution of virulence factors, using PCR and iii) to evaluate their antibiotic resistance profile, using disk-diffusion and D-zone tests. The findings regarding virulence and resistance were compared to serotypes, pregnancy, geographic localization and the site where the sample was isolated. A total of 292 strains from pregnant and nonpregnant women from the cities of São Paulo, São José dos Campos and Rio de Janeiro were analyzed. Serotype Ia was the most prevalent among the strains. In São José dos Campos there was no significate difference in the prevalence of serotypes Ia and V. Serotype V was the most abundant in São Paulo and Rio de Janeiro. Serotype II was most prevalent in nonpregnant women when compared to pregnant women. No resistance to Penicillin nor Vancomycin was found. However, resistance to Cefepime, Erythromycin or Clindamycin was found in around 22% of strains. There were differences among serotypes regarding resistance, virulence genes and site where the strain was isolated. Therefore these differences can reflect into the epidemiologic profile of S. agalactiae infection in regards to geographic localization and pregnancy. The incidence of sepsis caused by S. agalactiae has decrease in the last few decades, however constant monitoring is necessary in order to align clinical practice to the microorganisms phenotypical characteristics

Suscetibilidade antimicrobiana de Streptococcus agalactiae isolados de gestantes em um hospital materno infantil de Porto Alegre, Rio Grande do Sul / Antimicrobial susceptibility of Streptococcus agalactiae isolated from pregnant women at a maternity hospital in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil

OBJETIVOS: Caracterizar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Streptococcus agalactiae isolados de gestantes atendidas em um hospital público. MÉTODOS: O estudo foi realizado em um hospital materno-infantil público de Porto Alegre, RS, no qual a pesquisa de S. agalactiae em gestantes faz parte da rotina obstétrica. Foram incluídas no estudo as pesquisas por swab anal/vaginal realizadas no período de julho de 2015 a fevereiro de 2016. Os isolados bacterianos foram identificados por testes fenotípicos e foi determinada a suscetibilidade aos antimicrobianos ampicilina, clindamicina, eritromicina e ofloxacino. Foram investigados também os genes de resistência à eritromicina ermB e mefA. RESULTADOS: No total, 294 coletas foram incluídas e destas, 26 (8%) foram positivas para S. agalactiae. Todos os isolados avaliados foram sensíveis à ampicilina e foram observadas resistências à eritromicina (21,4%), clindamicina (14,3%) e ofloxacino (7,1%), sendo que 66% dos isolados resistentes à eritromicina apresentaram o genótipo mefA. CONCLUSÕES: Os resultados deste estudo corroboram com o consenso de que em gestantes colonizadas com S. agalactiae é aconselhada a antibioticoprofilaxia intraparto com penicilina G ou ampicilina. A expressiva proporção de isolados resistentes à eritromicina e clindamicina, indicados para a antibioticoprofilaxia intraparto em caso de alergia aos antibióticos beta-lactâmicos, enfatiza a importância da determinação do perfil de suscetibilidade antimicrobiana prévia desses isolados, medida que ainda não faz parte da rotina de exames pré-natais em muitas instituições.

AIMS: To characterize the antimicrobial susceptibility profile of Streptococcus agalactiae isolated from pregnant women attended at a public hospital. METHODS: The study was carried out in a public maternal and child hospital in Porto Alegre, RS, Brazil, in which the screening for S. agalactiae in pregnant women is part of the obstetrics routine. The study was carried out on anal/vaginal swab tests performed from July 2015 to February 2016. Bacterial isolates were identified by phenotypic tests, and the susceptibility to ampicillin, clindamycin, erythromycin and ofloxacin was determined. The erythromycin resistance genes ermB and mefA were also investigated. RESULTS: A total of 294 samples were included, and of these, 26 (8%) were positive for S. agalactiae. All isolates were susceptible to ampicillin, and resistance to erythromycin (21.4%), clindamycin (14.3%) and ofloxacin (7.1%) were observed. The mefA genotype was observed in 66% of the erythromycin resistant isolates. CONCLUSIONS: Results of this study corroborate the consensus that in pregnant women colonized with S. agalactiae, intrapartum antibiotic prophylaxis with penicillin G or ampicillin is indicated. The relevant proportion of isolates resistant to erythromycin and clindamycin, indicated for intrapartum antibiotic prophylaxis in case of allergy to beta-lactam antibiotics, emphasizes the importance of determining the profile of antimicrobial susceptibility of these isolates, a measure that is not yet part of routine prenatal tests in many institutions.

Molecular Characterization of Group B Streptococcus Serotypes By Multiplex Polymerase Chain Reaction / Caracterização molecular dos sorotipos de estreptococos do grupo b por reação multiplex pcr

OBJECTIVE: Group B Streptococcus (GBS) serotypes (Ia, Ib and II to IX) are classified based on variations in their capsular polysaccharide; their prevalence differs between different geographic areas. We examined the prevalence of all GBS serotypes in rectal and vaginal swab samples obtained from 363 pregnant women followed at a Brazilian referral center (Hospital da Mulher Professor Doutor José Aristodemo Pinotti); bacterial susceptibility to antibiotics was further determined. METHOD: Prevalence of positive GBS was evaluated by latex agglutination and by multiplex PCR analysis; bacterial susceptibility to antibiotics, such as clindamycin, erythromycin, levofloxacin, linezolid, penicillin and tetracycline was determined by the disk diffusion method. RESULTS: (a) standard GBS culture and the multiplex PCR analysis tested positive for 83 swabs, collected from 72 women (prevalence of GBS colonization: 72/363; 20%); the most prevalent Serotype was Ia (n=43/83; 52%), followed by serotype V (n=14/83; 17%); according to anatomical origin, serotype Ia accounted for 27/59 (46%) and 16/24 (67%) of the vaginal and rectal samples, respectively; PCR also identified serotypes Ib, II, III and VI. Serotype VI is rarely described and had not been previously reported in Brazil or in Latin America. (b) The latex agglutination test only identified 44 positive samples, all of which were serotyped: 34 of these samples (77%) had serotypes matching those identified by multiplex PCR. (c) Only one sample (serotype Ia) showed resistance to erythromycin and clindamycin. CONCLUSION: Regional studies on GBS serotypes prevalence are essential to guide immunoprophylactic interventions (vaccines) and the implementation of adequate antibiotic prophylaxis or treatment. In this study, the incidence of the serotype VI, a new and rare serotype of GBS was described for the first time in a Brazilian population.

OBJETIVO: Os sorotipos (Ia, Ib e II ao IX) do estreptococo do grupo B (GBS) são classificados baseado nas variações em seus polissacarídeos capsulares; sua prevalência difere entre diferentes áreas geográficas. Nós examinamos a prevalência de todos os sorotipos do estreptococo do grupo B em amostras de swabs vaginal e retal obtidas de 363 mulheres seguidas em um centro de referência brasileiro, o Hospital da Mulher Professor Doutor José Aristodemo Pinotti; a susceptibilidade bacteriana a antibióticos foi também determinada. MÉTODO A prevalência de estreptococo do grupo B positivo foi avaliada por aglutinação em látex e através de análise por multiplex PCR; susceptibilidade bacteriana a antibióticos, tais como clindamicina, eritromicina, levofloxacin, linezolide, penicilina e tetraciclina foi determinada pelo método de disco difusão. RESULTADOS: (a) Tanto a cultura padrão para estreptococo do grupo B quanto a análise por multiplex PCR testaram positivos para 83 swabs. A prevalência para colonização por GBS foi 20%. O sorotipo Ia foi o mais prevalente (n= 43/83; 52%), seguido pelo sorotipo V (n= 14/83; 17%); De acordo com a origem anatômica, o sorotipo Ia positivou 27/59 (46%) e 16/24 (67%) das amostras vaginais e retais, respectivamente; o teste de PCR também identificou os sorotipos Ib, II, III, VI. O sorotipo VI é raramente descrito e não reportado no Brasil ou na América Latina até esta data. (b) O teste de aglutinação em látex somente identificou 44 amostras positivas, todas das quais foram sorotipadas: 34 destas amostras (77%) tiveram os sorotipos coincidindo com aqueles identificados pela multiplex PCR. (c) Somente uma amostra (sorotipo Ia) mostrou resistência a eritromicina e clindamicina. CONCLUSÃO: Estudos regionais sobre a prevalência dos sorotipos do estreptococo do grupo B são essenciais para guiar medidas imunoprofiláticas (vacinas) e a implementação de adequada antibiótico profilaxia. Neste estudo, a incidência do sorotipo VI foi descrita pela primeira vez na população Brasileira, um novo e raro sorotipo do estreptococo do grupo B.

Apoptose induzida por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549 / Apoptosis induced by group B streptococci in respiratory epithelial cells A549

Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax...

Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential Δψm with Bax colocalization...

Enfermedad neonatal temprana por Streptococcus agalactiae en una unidad de recién nacidos, factores de riesgo materno-fetales asociados a severidad y mortalidad / Streptococcus agalactiae early neonatal disease in a nursery, neonatal and maternal risk factors associated with severity and mortality / No início da doença neonatal causada pelo Streptococcus agalactiae em um viveiro, os fatores de risco materno-fetal associados com a gravidade e mortalidade

La colonización materna por estreptococo del grupo B (SGB) en países en desarrollo es del 4-20%; el 50% de sus hijos nacen colonizados y el 1-2% desarrollan enfermedad invasiva con alto riesgo de morbimortalidad y secuelas. Objetivo: determinar los factores de riesgo materno-fetales asociados a enfermedad severa y mortalidad neonatal por SGB en una unidad de recién nacidos. Materiales y métodos: se realizó un estudio observacional analítico de cohorte histórica durante un período de dos años. Se tomaron 11 casos con enfermedad invasiva y 15 controles. Se calcularon frecuencias absolutas y relativas, y se buscaron asociaciones mediante el cálculo del estadístico chi². Resultados: los factores maternos predictivos para enfermedad por SGB incluyeron fiebre periparto mayor a 37,5 grados centígrados (p < 0,05), corioamnionitis y ruptura de membranas mayor a 18 horas (p < 0,05). Los factores de riesgo neonatal incluyeron prematurez (< 37 semanas) y bajo peso al nacer (< 2.500 gramos) (p < 0,05). Se encontró una mortalidad de 5 (45%). Conclusiones: hubo relación estadísticamente significativa entre la corioaminionitis materna, la ruptura de membranas mayor a 18 horas, la prematurez y el peso bajo al nacer con la severidad de la enfermedad y la mortalidad. La incidencia estimada de infección neonatal en la unidad de recién nacidos fue de 1,8 casos/1.000 nacidos vivos, y la de colonización materna fue de 4,3 casos/1.000 maternas. Se deben realizar más estudios en el país para establecer la incidencia real de enfermedad neonatal por SGB y hacer investigación sobre la costo-efectividad de las medidas de prevención.

Maternal colonization of group B Streptococcus (GBS) in developing countries is 4-20%, 50% of their children born colonized and 1-2% develop invasive disease at high risk of mortality and sequelae. Objective: determine maternal-fetal risk factors associated with severe disease and mortality of GBS in a neonatal nursery. Materials and methods: an observational study of historical cohort during a period of 2 years. It took eleven cases with invasive disease and fifteen controls. We calculated absolute and relative frequencies and associations were sought by calculating the statistic chi². Results: The predictive maternal factors included GBS disease, peripartum fever greater than 37.5 degrees Celsius (p < 0.05), chorioamnionitis and rupture of membranes more than 18 hours (p < 0.05). Neonatal risk factors included prematurity (< 37 weeks) and low birth weight (< 2500 grams) (p < 0.05). We found a mortality of 5 (45%). Conclusions: There was a statistically significant relationship between maternal chorioamnionitis, rupture of membranes more than 18 hours, prematurity and low birth weight with disease severity and mortality. The estimated incidence of neonatal infection in the nursery was 1.8 per 1000 live births and maternal colonization was 4.3 cases per 1000 maternal. Further studies should be conducted in the country to establish the true incidence of neonatal GBS disease and do research on cost-effectiveness of preventive measures.

A colonização materna por estreptococo do grupo B (SGB) em países em desenvolvimento é de 4-20%, 50% de seus filhos nascem e o 1-2% desenvolvem doença invasiva com alto risco de morbimortalidade e seqüelas. Objetivo: determinar os fatores de risco materno-fetais associados à doença severa e mortalidade neonatal por SGB em uma unidade de recém-nascidos. Materiais e Métodos: realizou-se um estudo observacional analítico coorte histórica durante um período de 2 anos. Tomaram-se onze casos com doença invasiva e quinze controles. Calcularam-se freqüências absolutas e relativas e se procuraram associações mediante o cálculo do estadístico Chi². Resultados: os fatores maternos preditivos para doença por SGB incluíram, febre periparto maior a 37,5 graus centígrados (p <0.05), corioamnionite e rotura de membranas maior a 18 horas (p<0.05). Os fatores de risco neonatal incluíram prematuridade (<37 semanas) e baixo peso ao nascer (<2500 gramas) (p<0.05). Encontrou-se uma mortalidade de 5(45%). Conclusões: houve relação estadisticamente significativa entre a corioamnionite materna, a rotura de membranas maior a 18 horas, a prematuridade e o baixo peso ao nascer com a severidade da doença e a mortalidade. A incidência estimada de infecção neonatal na unidade de recém-nascidos foi de 1,8 casos/1000 nascidos vivos e a clonização materna foi de 4,3 casos/1000 maternas. Devem-se realizar mais estudos no país para estabelecer a incidência real de doença neonatal por SGB e fazer pesquisa sobre a custo-efetividade das medidas de prevenção.

Papel de metaloproteases de Estreptococos do grupo B na interação, viabilidade celular e indução de apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais humanas / Role of metalloproteinases of Group B Streptococci in the interaction, cell viability and induction of apoptosis and necrosis in human epithelial and endothelial cells

Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases molecular...

Group B streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal sepsis and meningitis and has recently been recognized as an increasingly common cause of invasive disease in immunocompromised adults (elderly or chronic diseases). GBS produces a number of extracellular enzymes, several of which interact with the host immune system and are important for the GBS- host interaction and for the development of disease. Previous studies showed that metalloproteases are involved in several metabolic pathways in different cellular types. For this reason, we decided to investigate the possible involvement of GBS metalloproteases during cell interaction and apoptosis/necrosis induced by microorganism in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and epithelial respiratory cells line (A549). Treatment of GBS with metalloproteases inhibitors (EDTA, EGTA and PHEN) did not induce alteration on bacterial growth, but promoted changes in the expression of surface proteins, adhesive capacity and profile of intracellular survival of the pathogen. The GBS and supernatant of bacterial growth medium (conditioned medium; MC) promoted the death of HUVEC and A549 cells. However, the metalloproteases inhibitors treatment restored the cellular viability induced by GBS and MC, suggesting that GBS metalloproteases are involved in the disruption of cell barrier, promoting bacterial dissemination. This study describes for the first time apoptosis and necrosis induced by GBS and MC in HUVEC and A549 cells after 24h incubation, respectively. We also observe reduction of pro-caspase-3 after infection of HUVEC with GBS and MC, suggesting activation of caspase-3. Moreover, the over-expression of pro -apoptotic protein Bax and decrease of anti-apoptotic protein Bcl-2 levels in HUVEC show the involvement of mitochondrial apoptotic mechanism (intrinsic via). Enhanced understanding of the molecular basis of GBS pathogenesis may pinpoint novel bacterial and host molecules that can represent novel...