Produção e purificação integrada de protease fibrinolítica de Mucor subtilissimus UCP 1262 / Integrated production and purification of fibrinolytic protease from Mucor subtilissimus UCP 1262

As enzimas fibrinolíticas podem ser obtidas de micro-organismos por meio de processos fermentativos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção e extração integrada da protease fibrinolítica de Mucor subtilissimus UCP 1262 usando sistema de duas fases aquosas (SDFA). O processo integrado foi realizado para avaliar a produção, partição e recuperação da protease fibrinolítica, segundo planejamento experimental 23, utilizando como variáveis independentes a massa molar do polietileno glicol (PEG), a concentração do PEG e a concentração do sulfato de sódio. A maior atividade fibrinolítica (15,40U/mL) foi obtida na fase rica em sulfato de sódio no ensaio composto por 10% de sal e 18% de PEG 8000 (g/mol). Recuperações superiores a 80% foram obtidas. A protease fibrinolítica apresentou pH ótimo 7,0, estabilidade entre os pH 6,0 e 8,5, temperatura ótima 50°C, sendo estável de 10°C a 50°C. A enzima foi classificada como uma serino protease, com massa molecular de 52kDa. Como resultado, o processo é notavelmente eficaz para pré-purificar a protease fibrinolítica com baixo custo e rapidez significativa. Quando comparada a outras técnicas de produção e purificação isoladas, a fermentação extrativa é um processo digno a ser substituto das etapas iniciais de separação convencionais.(AU)

Fibrinolytic enzymes can be obtained from microorganisms through fermentative processes. The study aimed to evaluate the fibrinolytic protease production and integrated extraction from Mucor subtilissimus UCP 1262 by extractive fermentation using Aqueous Two-Phase Systems (ATPS). The integrated process was carried out to assess the production, partition and fibrinolytic enzyme recovery, according to a 2 3 -experimental design, using as independent variables Polyethylene glycol (PEG) molar mass, PEG and sodium sulphate concentration, concentration. The highest fibrinolytic activity (15.40U/mL) was obtained in sodium sulfate rich phase in the assay comprising of 10% of salt and 18% of PEG 8000 (g/mol). Yield greater than 80% was obtained. The fibrinolytic protease presented optimum pH 7.0 and stability between pH 6.0 and 8.5, and optimum temperature 50°C, stable between 10°C to 50°C. The enzyme was classified as a serine-protease with 52kDa of molecular weight. As a result, the process is remarkably effective to pre-purify the fibrinolytic protease with a low cost and significantly faster processing time. When compared to other isolated production and purification techniques the extractive fermentation is worthy of being a candidate to replace the initial stages of conventional separation processes.(AU)

Overproduction of clavulanic acid by extractive fermentation

Background Clavulanic acid is an important beta-lactamase inhibitor produced as a secondary metabolite by the actinomycete Streptomyces clavuligerus. Clavulanic acid is chemically unstable; therefore, it is degraded during bacterial cultivation. In this work, the adsorbents clinoptilolite, activated carbon, calcined hydrotalcite, and Amberlite IRA 400 anionic exchange resin were studied in terms of their ability to adsorb clavulanic acid during extractive fermentation, in order to prevent product degradation and avoid product concentrations reaching inhibitory levels. Adsorption assays were used to investigate the effect of pH, and the decrease in the clavulanic acid concentration in the culture broth was measured for each adsorbent. Results IRA 400 was found to be most effective, with 78% adsorption of clavulanic acid. The maximum production of clavulanic acid in Erlenmeyer flask cultures increased 86% in terms of mass of CA, and 248% in cumulative CA concentration, with the use of Amberlite IRA 400 as adsorbent in extractive fermentation, compared to control fermentation performed without product removal. Conclusions The results indicated that extractive fermentation using a solid phase could be an important way of enhancing clavulanic acid titers. It was also possible to show that clavulanic acid acts as an inhibitor of its own synthesis.

Utilização de sistemas poliméricos de duas fases aquosas (SPDFA) compostos por polietileno glicol/ácido poliacrílico (PEG/APA) para extração de ácido clavulânico / Utilization of aqueous two phase systems (ATPS) composed of polyethylene glycol/polyacrylic acid (PEG/APA) in the extraction of clavulanic acid

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco

The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study

Produção e extração de ácido clavulânico de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistemas de duas fases aquo / Production and extraction of clavulanic acid from Streptomyces spp. by extractive fermentation using aqueous two-phase system

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32ºC, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32ºC e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32ºC é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC...

Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 ºC, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 ºC and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 ºC is the maximum temperature production of CA, after this value, starts…

Fermentación alcohólica del lactosuero por Kluyveromyces marxianus y solventes orgánicos como extractantes / Lactoserum alcoholic fermentation by Kluyveromyces marxianus and organic solvents as extractants

Las fermentaciones alcohólicas son realizadas a bajas concentraciones de azúcares, para evitar la inhibición por productos o substratos. La fermentación alcohólica extractiva es utilizada en procesos limitados por la concentración de etanol final. Se estudió la fermentación alcohólica del lactosuero evitando la inhibición del Kluyveromyces marxianus, con la adición de solventes de extracción (ácido oleico, hexadecano, butil laurato y aceite de soja) como extractantes del etanol. Se evaluó la biocompatibilidad, cinética de extracción de los solventes, consumo de sustrato, producción de etanol, crecimiento celular (sin solventes y con solventes seleccionados como mejores extractantes y biocompatibles) y rendimientos globales. El ácido oleico y el aceite de soja fueron los mejores solventes de extracción. La velocidad específica de crecimiento se incrementó con el uso de solventes, siendo mayor con el uso de aceite de soja. La lactosa consumida fue de 97 g/L para la fermentación extractiva con ácido oleico, 81,2 g/L con aceite de soja, y 64 g/L para la fermentación convencional. Se obtuvieron 53 y 44 g/L de etanol con ácido oleico y aceite de soja respectivamente, y 35 g/L de etanol con la fermentación convencional. Queda demostrado que la fermentación alcohólica usando acido oleico puede ser usada para reducir la concentración de etanol en el medio y evitar la inhibición de la levadura en el proceso, lo que conlleva a la posibilidad de usar un substrato con altas concentraciones de azúcares, produciendo un incremento en la productividad del sistema.

Alcoholic fermentations are done under low sugar concentrations to avoid product or substrate inhibition. Extractive alcoholic fermentation is used in processes limited by the final ethanol concentration. Lactoserum alcoholic fermentation avoiding the inhibition of Kluyveromyces marxianus by the addition of extraction solvents (oleic acid, hexadecane, butyl laureate and soy oil) as ethanol extractants was studied. Biocompatibility, extraction kinetic of the solvents, substrate use, ethanol production, cell growth (without solvents and with solvents selected as the best extractants and biocompatible), and global yield were evaluated. Oleic acid and soy oil were the best extraction solvents. Specific growth speed was increased by the use of solvents; the greatest increase was obtained with soy oil. Lactose consumption was 97 g/L for oleic acid extractive fermentation, 81.2 g/L for soy oil, and 64 g/L for conventional fermentation. The ethanol yield was 53 and 44 g/L with oleic acid and soy oil fermentation respectively, and 35 g/L with conventional fermentation. This study demonstrates that oleic acid alcoholic fermentation can be used to reduce the ethanol concentration in the medium and to avoid the inhibition of the yeasts during the process, which entails the possibility of using substrates with high sugar concentrations, obtaining an increase in the productivity of the system.