RESUMEN
Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
RESUMEN
Se evaluó la dinámica de la actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) en corteza de frutos de lulo (Solanum quitoense Lam) con el fin de determinar su participación en respuestas bioquímicas hacia Colletotrichum acutatum. Se establecieron como mejores condiciones para la extracción de la enzima, buffer ácido bórico-borato de sodio 0.1M pH 8.8, 1% SDS, 3% PVPP y para medir la actividad, sustrato L-fenilalanina 5 mM , pH 8,0, 20°C , 30 ΜL de extracto y 45 min. Se realizó un ensayo in vivo usando frutos en tres estados de madurez, los cuales fueron inoculados con el patógeno o tratados con agua estéril. A cinco tiempos (hpi = horas post-infección) se determinó la actividad PAL y el contenido total de fenoles, encontrándose que hay una respuesta diferencial de la enzima por efecto del patógeno y por el estado de madurez. Para frutos en el estado pintón se obtuvo el mayor aumento de PAL, el que perduró hasta 48 hpi, al compararlo con los controles y con los otros dos estados de madurez. Este aumento mostró relación con un marcado incremento en el contenido total de fenoles y con el desarrollo más tardío de síntomas característicos de antracnosis, observado para los frutos pintones. Estos resultados permiten postular, una posible relación positiva entre inducción de PAL, aumento de fenólicos y respuesta de tolerancia a C. acutatum. Para lulos en estado verde y maduro se observó aumento de PAL a 12 y 24 hpi que coincidió también con incremento en el contenido de fenoles totales, aunque para estos dos últimos estados dicho contenido disminuyó significativamente a tiempos mayores.
Phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity induction was evaluated in lulo fruits to determine the role of this enzyme in biochemical responses towards the pathogen Colletotrichum acutatum. We studied the experimental conditions to obtain the enzyme, using lulo peel, and found that the best conditions for extraction were buffer of boric acid-sodium borate 0.1M pH 8.8, 1% SDS, 3% PVPP and, for measuring the enzymatic activity: L- phenylalanine 5mM, pH 8.0, 20°C , 30 ΜL of extract and incubation during 45 min. Then, we performed an in vivo assay using lulo fruits in three maturity stages, which were inoculated either with the fungus or sterile water. Enzymatic induction was studied at five post-inoculation times, and it was found that there is a differential response as a consequence of the presence of the pathogen and the maturity stage. In semi-mature lulos, a bigger increase in PAL was obtained among 12-48 hpi which is related to a higher content of phenolic compounds and to the latest development in the characteristic symptoms of anthracnose. These results allow postulating, in a preliminary way, a possible positive relationship between inductions of PAL, phenolics and responses of tolerance to C. acutatum. For green and mature lulos we observed as well, an increase of PAL activity but only at 12 and 24 hpi which showed relation with an increase in the total phenolic content. However, for these stages the phenolics were significantly lower at higher times.
RESUMEN
Con el fin de evaluar el comportamiento a nivel del tallo de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, por su nombre en inglés phenylalanine ammonia liase), durante la interacción clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2, se seleccionaron las condiciones para su extracción y cuantificación de la actividad. Para la extracción a partir de tallos y raíces se seleccionó un tratamiento previo del material vegetal con acetona y posterior extracción con buffer borato pH 8,8 con EDTA 2mMy ß-mercaptoetanol 18 mM. Para su cuantificación a nivel del tallo se debe realizar un ensayo discontinuo por 10 min, a 37 oC, pH 8,0 y a una concentración de sustrato de 35 mM. Adicionalmente se muestra mediante un ensayo in vivo el efecto que tiene, como inductor de esta enzima, la aplicación de un extracto crudo del patógeno. Los resultados observados indican que esta enzima se induce significativamente en tallos de claveles de la variedad tolerante Kiss durante el tratamiento por aspersión con el extracto crudo del patógeno, mientras que dicha inducción fue inexistente para la infección directamente con el patógeno. La inducción en esta variedad indica que en este extracto del patógeno se presentan elicitores potenciales para la inducción de esta enzima y por ende de la ruta fenilpropanoide.
The conditions of extraction and quantification of activity during interaction of carnation and Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 were selected to evaluate the dynamics of the enzyme Phenylalanine Ammonium Lyase (PAL) at the carnations steam. For the extraction from roots and stems a previous treatment with acetone and extraction with borate pH 8.8, EDTA 2 mMand mercaptoethanol 18 mM buffer were selected. For the quantification at steam level a discontinous assay for 10 min at 37 °C, pH 8.0 and substrate concentration 35mMshould be done. In addition an in vivo assay shows the effect that the applications of a raw extract of the pathogen as inductor of this enzyme. The results show that the enzyme is significantly induced in carnations stems of the tolerant variety Kiss during the treatment by aspersion with raw extract of the pathogen while the induction was non existing for direct infection with the pathogen. The induction in this variety shows that in the pathogen extract are present elicitors for the induction of this enzyme and thus the phenylpropanoid path.
Para avaliar o comportamento da enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, pelo seu nome em inglês phenylalanine ammonia liase) no caule durante a interação cravo- Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2, foram seleccionadas as condiçes ideais para a sua extração e quantificação na atividade. Para a extração a partir de caules e raízes foi seleccionado um tratamento prévio do material vegetal com acetona e posterior extração com borato pH 8,8 com EDTA 2 mMe ß-mercaptoetanol 18 mM. Para a quantificação da enzima no caule, deve-se realizar um ensaio descontínuo por 10 min., a 37 °C, pH 8,0 e a uma concentração de substrato de 35 mM. Além do mais, mostra-se mediante um ensaio in vivo, o efeito que tem como inductor desta enzima a aplicação de um extracto cru do patógeno. Os resultados observados indicam que esta enzima é induzida significativamente en caules de cravos da variedade tolerante Kiss durante o tratamento por aspersão com o extrato cru do patógeno, enquanto que esta indução foi inexistente para a infecção directa com o patógeno. A indução apresentada nesta variedade indica que neste extrato do patógeno estão presentes potencias elicitores para a indução desta enzima e portanto da rota fenilpropanoide.