Análise molecular da expressão do fenótipo multi-droga resistente (MDR) em enterobactérias isoladas de amostras clínicas após exposição in vitro ao Imipenem / Molecular analysis of multi-drug resistant phenotype expression (MDR) in enterobacteria isolated from clinical specimens after exposure in vitro to imipenem

Após o surgimento e disseminação das ß-lactamases de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenemeertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha devido à estabilidade apresentada contra estas enzimas. A desvantagem destes antibióticos é a sua capacidade de induzir resistência aos ß-lactâmicos e a outros antibióticos quimicamente não relacionados. O imipenem tem favorecido a indução de cefalosporinases cromossômicas (AmpC) e também tem sido relacionado, in vivo, com a seleção de mecanismos intrínsecos de resistência, contribuindo com o perfil multi -droga resistente (MDR). Esse perfil é freqüentemente associado à diminuição da permeabilidade por alteração na síntese de porinas em conjunto com um aumento da atividade de bombas de efluxo, as quais não permitem o estabelecimento de uma concentração ativa do antibiótico no interior da célula bacteriana. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o estabelecimento do perfil MDR em enterobactérias provenientes de isolados clínicos em função da exposição a diferentes concentrações de imipenemin vitro. A seleção do grupo das amostras estudadas foi feito por meio da determinação do perfil de sensibilidade dos isolados, tipagem molecular e ensaio de hidrólise de Imipenem. Nos isolados selecionados para a indução foi realizada numa etapa inicial (etapa basal) a análise de porinas de membrana externa por SDS-PAGE e o estudo de genes codificadores de ß-lactamases pela técnica de PCR. O estudo do estabelecimento do perfil MDR foi feito por meio de passagens sucessivas das amostras em meio contendo concentrações sub-inibitórias de imipenem seguido de análise fenotípica (CIM e acúmulo do antibiótico intracelular e SDS-PAGE), e a análise da expressão gênica de genes associados a permeabilidade de membrana (ompC, ompF eAcrA) e genes reguladores(marA e ompR). Após a indução com o imipenem, 77% dos isolados induzidos aumentaram a CIM para os carbapenêmicos, mudando assim o perfil de resistência observado na etapa basal Também foi afetado o perfil de resistência para outros antibióticos não relacionados a ß-lactámicos, porém numa percentagem menor. Com relação à alteração da permeabilidade, a perda de porina foi observada apenas para um isolado, no entanto a diminuição na expressão gênica de Omp36 foi significativa desde o começo da indução. A expressão da bomba de efluxoAcrAB foi afetada pela indução com imipenem, aumentando significativamente a expressão de AcrA, enquanto os reguladores estudados, MarA e OmpR tiveram a sua expressão induzida pelo imipenem. Foi possível observar também associação do nível de expressão gênica do regulador MarA com a expressão de AcrA,porém não foi possível observar uma associação estatisticamente significativa deste regulador com o perfil de expressão de OMPs. A indução de OmpR foi associado com um aumento da expressão de RNAm de Omp35, já para Omp36 foi possível observar apenas uma tendência na repressão deste gene. O estudo da resposta destes genes reguladores e determinantes de resistência, em resposta à exposição ao com o imipenem in vitro, permitiu reportar o comportamento molecular da bactéria numa resposta adaptativa no estagio inicial do estabelecimento do fenótipo MDR. A utilização de isolados clínicos com diversos determinantes de resistência permitiu observar a variabilidade nas respostas adaptativas das enterobacterias, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de adaptação da bactéria e sua contribuição na falha terapêutica

After emergence and broad dissemination of extended spectrum ß-lactamases into the Enterobacteriaceae family, the carbapenemic antibiotics (imipenem, meropenem and ertapenem) have been considered the chosen therapy in the treatment of nosocomial infections by the stability that these antibiotics show to these enzymes. The disadvantage of carbapenems is theirs capacity to induce resistance against ß-lactamics and to other chemically unrelated antibiotics. The imipenem has been shown to induce chromosomal cephalosporinases (AmpC) and it was also related, in vivo, with the selection of intrinsic mechanism leading to multi-drug resistance profile (MDR). This profile is usually associated with membrane impermeability due to reduced outer membrane porin synthesis with an incremented activity of efflux pumps, which results in a reduced concentration of antibiotics inside the bacteria. This study aimed to evaluate the establishment of the MDR profile in Enterobacteriaceae from clinical isolates by exposure to different concentrations of imipenem in vitro. The selection of the study group was performed by determination of antibiotic susceptibility profile,molecular typing and hydrolysis assay of imipenem. In the selected isolates submitted to induction, in an initial step (baseline), was performed the outer membrane porin analysis by SDS-PAGE and the gene-specific amplification of B-lactamase enzymes by PCR. The study of the establishment of MDR was performed by progressive passages with subclinical concentrations of imipenem, followed each one by the evaluation of phenotypic profile (MIC, accumulation antibiotic in celland SDS-PAGE) and gene expression analysisof genes related to membrane permeability (ompC, ompF and acrA) and regulatory genes(MarA and ompR). After induction with imipenem, 77 % of the isolates increased the MIC for the carbapenems, changing the resistance profile at the baseline. In a lesser percentage, the resistance profile to other ß-lactams-unrelated antibiotics was also affected. Loss of porin was observed only for an isolated, however a significantly decreased Omp36 mRNA expression was observed from the start of induction. The expression of the efflux pump AcrAB ,was also affected by the imipenem induction, significantly increasing the AcrA gene expression, whereas the studied regulatory genes,MarA and OmpR,were induced by the imipenem. It was also possible to observe an association between the expression of the regulator MarA and the expression of AcrA, nevertheless no association was observed between this regulator and OMPs . OmpR induction was associated with an increased Omp35mRNA expression, however only a trend for the repression of Omp36was observed. The study of the response of these regulatory genes and genetic determinants of resistance, in response to the imipenem exposure in vitro, allowed to report the molecular behavior of the bacteria in an adaptive response in the initial stage of the establishment of a MDR phenotype. The use of clinical isolates with diverse resistance determinants allowed observing the variability in adaptive responses in enterobacteria, which is important to understand the adaptive mechanisms of bacteria to this antibiotic, the involvement in the emergence of the MDR profile and its contribution to the treatment failure

Superação da dormência em sementes de visgueiro-do-igapó (Parkia discolor) / Overcoming seed dormancy in visgueiro-of-the-igapó (Parkia discolor)

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da aplicação de tratamentos pré-germinativos de escarificação mecânica, bem como pré-tratamentos com calor, sobre a germinação de sementes de visgueiro-do-igapó (Parkia discolor Spruce ex Benth.). No primeiro experimento, sob delineamento inteiramente ao acaso, com quatro repetições, foram avaliados os pré-tratamentos: testemunha (sem pré-tratamento); desponte no lado distal; desponte no lado proximal; desponte nos lados distal e proximal; lixamento no lado distal; lixamento no lado proximal; lixamento nos lados distal e proximal; perfuração do tegumento com ferro-de-solda; e perfuração com pirógrafo. No segundo experimento, foi adotado o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 (calor: seco e úmido) x 4 (temperatura: 40ºC, 50ºC, 60ºC e 70ºC) x 5 (período de condicionamento: 6, 16, 24, 30 e 48 horas), com três repetições. O desponte ou lixamento das sementes na porção proximal e porções proximal e distal possibilitaram uma embebição mais rápida (143-163 por cento, aos três dias e meio) e, conseqüentemente, melhores resultados de germinação (98-100 por cento, aos quatro dias), do índice de velocidade de germinação (1,351-1,460) e do tempo médio de germinação (3 dias). Os pré-tratamentos com calor (úmido e seco), sob diferentes temperaturas, e por vários períodos de condicionamento não superaram a dormência de sementes de P. discolor.

This study aimed to evaluate the effects of pregerminative mechanical scarification treatments, as well as heat pre-treatments on the germination of visgueiro-of-the-igapó (Parkia discolor Spruce ex Benth.) seeds. The first experiment, with a completely randomized design and four repetitions, evaluated these pre-treatments: control (without pre-treatment); clipping at the distal portion; clipping at the proximal portion (hilum); clipping at the proximal and distal portions; scraping at the distal portion; scraping at the proximal portion; scraping at the proximal and distal portions; perforation of the husk with a soldering-iron; and perforation by pyrography. In the second experiment, with a completely randomized design and factorial 2 (heat: dry and wet) x 4 (temperature: 40ºC, 50ºC, 60ºC and 70ºC) x 5 (period of conditioning: 6, 16, 24, 30 and 48 hours), with three repetitions. The clipping or scraping of the seeds in the proximal portion and proximal and distal portions allowed faster imbibition of the seeds (143-163 percent in three days and half), and consequently, better germination (98-100 percent in four days), germination speed rate (1,351-1,460) and average time of germination (3 days). The pre-treatment with heat (wet and dry), under different temperatures and different conditioning periods did not overcome the dormancy of P. discolor seeds.

Análise temporal da permeabilidade da superfície urbana da sub-bacia do córrego centenário em Lavras, MG / Temporal analysis of permeability urban surfaces locaty of the Centenário sub-basin creek in Lavras, MG

Nos últimos anos, séries de estudos têm sido realizadas por estudiosos de diferentes áreas para estabelecer os efeitos da urbanização na hidrologia de sub-bacias. O processo de urbanização freqüentemente produz alterações na drenagem da água pluvial. Um SIG com dados cadastrais planaltimétricos e fotografias aéreas permitiram estudar a ocupação em 3 diferentes períodos (1999, 1986 e 1971) na sub-bacia do Centenário, na cidade de Lavras, MG. Objetivou-se com este estudo realizar a análise temporal da permeabilidade da superfície na sub-bacia do Centenário comparando os 3 períodos. A permeabilidade da superfície urbana foi obtida pela análise da ocupação dos quarteirões por área construída ou pavimentada. Os resultados permitiram verificar que a permeabilidade da superfície decaiu de 1971 para 1999. Nestes anos a área urbana cresceu reduzindo a permeabilidade do solo da sub-bacia. Conclui-se que, sendo óbvio que a urbanização causou impactos na sub-bacia, as metodologias utilizadas para essas análises foram muito eficientes para determinar os impactos de superfícies impermeáveis.

Over the past years, a series of studies have been undertaken by scientists of different areas, to assess the effects of urbanization on the hidrology of subbasins. The urbanization process has frequently been done alterations on the drainage of pluvial water. A GIS data base containing the cadastral planiltimetric charts and aerial photographies allowed to study the land occupation in three different periods (1999, 1986 and 1971) of the Centenário Subbasin in Lavras city, MG. So, the subject of this study was to realize a temporal analysis of the surface permeability of the Centenário subbasin comparing the three periods. The urban surface permeability was avaibled by the analysis of the city's squares occupation per builted or paved area. The results permitted verify that the surface permeability downed from 1971 to 1999 years. In these years the urban area growed up avoiding the soil subbasin permeability. The conclusion that urbanization caused impacts on the subbasin was obvious, however the methodologies employed for the analysis in this work were too much efficient to determine the impacts of impervious surfaces.