Evaluation of RT-PCR and hemi-nested RT-PCR in brain samples from dogs with neurologic signs compatible with distemper / Avaliação das técnicas de RT-PCR e heminested RT-PCR em cérebros de cães com sinais neurológicos compatíveis com cinomose

The diagnostic value of RT-PCR and hemi-nested RT-PCR (hnRT-PCR) was compared in brain samples of dogs presenting neurological signs compatible with canine distemper. Samples of central nervous system (CNS) were collected from 68 dogs and tested by direct immunofluorescence test (RFID) and, independent of the results, they were stored at -20°C for at least three years. They were submitted to the RT-PCR and hnRT-PCR techniques aiming to determine the gene responsible for the viral nucleoprotein decoding. Fifty-nine samples were positive for RIFD, 40 for RT-PCR (Kappa = 0.358) and 54 for hnRT-PCR (Kappa = 0.740). All nine RIFD negative samples were also negative for RT-PCR and hnRT-PCR. In spite of the storage duration and proper sample conditions, the estimated accordance between hnRT-PCR and RIFD demonstrated that hnRT-PCR technique can be applied in retrospective studies...

Foi comparado o valor diagnóstico das técnicas de RT-PCR e heminested RT-PCR (hnRT-PCR) em amostras de cérebro de cães com sintomatologia nervosa compatível com cinomose. Fragmentos do sistema nervoso central (SNC) colhidos de 68 animais foram testados pela Imunofluorescência direta (IFD) e, independentemente do resultado, foram armazenados a -20°C por pelo menos três anos. Após esse período, foram submetidos a RT-PCR e a hnRT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores direcionados ao gene codificador da nucleoproteína N. As proporções de resultados positivos/examinados foram: 59/68 para a IFD, 40/68 para a RT-PCR (Kappa = 0,358) e 54/68 quando associada à heminested PCR (Kappa = 0,740). Houve nove resultados negativos nas três técnicas empregadas. Os resultados do coeficiente Kappa entre a IFD e hnRT-PCR demonstram que apesar das condições de armazenamento, a hnRT-PCR pode ser utilizada em estudos retrospectivos...

Evaluación de la microscopía en fresco en el diagnóstico de neumocistosis pulmonar / Microscopio examination in fresh mount preparation for the diagnosis of pulmonary pneumocystosis / Avaliagáo da microscopia a fresco no diagnóstico de pneumocistose pulmonar

Para evaluar la utilidad de la microscopia en fresco en el diagnóstico de la neumocistosis pulmonar (PCP), se aplicó una técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos monoclonales a 50 secreciones respiratorias obtenidas por lavado broncoalveolar y procesadas en forma consecutiva en el Laboratorio de Parasitología, entre el 19 de enero y el 25 de febrero de 2011. Las mismas pertenecían a pacientes con SIDA y diagnóstico presuntivo de PCP, y en todas ellas la investigación de la presencia de exudados espumosos por microscopia en fresco fue negativa. Ninguna de las muestras procesadas resultó positiva para Pneumocystis jiroveci con la IFD. En base a los resultados obtenidos se concluyó que la microscopia en fresco permanece como un método rápido, económico, sencillo y seguro para el diagnóstico de la PCP en los pacientes con SIDA internados en diferentes Salas del Hospital Muñiz. Al igual que en un estudio previo, reveló poseer una sensibilidad similar a la IFD en los pacientes evaluados.

To evaluate the usefulness of fresh microscopy for the diagnosis of pulmonary pneumocystosis (PCP), direct immunofluorescence (DIF) with monoclonal antibodies technique was applied to 50 respiratory secretions obtained by bronchoalveolar lavage and consecutively processed in the Laboratory of Parasitology from January 19, 2011 to February 25, 2011. The samples belonged to AIDS patients with presumptive diagnosis of PCP, and all of them were negative for the search of foamy exudates by wet mountmicroscopy. No positive results were obtained for Pneumocystis jiroveci with the DIF. According to the results obtained, it was concluded that fresh microscopy remains being a rapid, economic, simple and accurate method for the diagnosis of PCP in AIDS patients assisted in different Wards of the Muñiz Hospital. As in a previous study, performed in a similar cohort of patients, fresh microscopy revealed a sensitivity similar to that of DIF when applied to the diagnosis of PCP.

Para avaliar a utilidade da microscopia a fresco no diagnóstico da pneumocistose pulmonar (PCP), foi aplicada uma técnica de imunofluorescencia direta (IFD) com anticorpos monoclonais em 50 secregóes respiratórias obtidas por lavagem broncoalveolar e processadas de forma consecutiva no Laboratório de Parasitologia, entre os dias 19 de janeiro de 2011 e 25 de fevereiro de 2011. As mesmas pertenciam a pacientes com AIDS e diagnóstico presuntivo de PCP, e em todas elas a pesquisa da presenga de esfregagos espumosos por microscopia a fresco foi negativa. Nenhuma das amostras processadas resultou positiva para Pneumocystis jiroveci com a IFD. Com base nos resultados obtidos foi concluido que a microscopia a fresco permanece como um método rápido, económico, simples e seguro para o diagnóstico da PCP nos pacientes com AIDS internados em diferentes. Salas do Hospital Muñiz. Do mesmo modo que num estudo prévio, revelou possuir uma sensibilidade similar a IFD nos pacientes avaliados.

A necessidade da imunofluorescência direta no diagnóstico da dermatose bolhosa por IgA / The need for direct immunofluorescence in the diagnosis of IgA bullous dermatosis

A dermatose bolhosa por imunoglobulina da classe A linear (DbIgA) do adulto é uma doença autoimune rara caracterizada por formação de bolhas subepidérmicas e depósito linear de imunoglobulina da classe A (IgA) na zona da membrana basal (ZMB). Por possuir aspectos clínicos e histológicos semelhantes a outras dermatoses bolhosas, principalmente a dermatite herpetiforme e o penfigoide bolhoso, faz-se necessária a realização de imunofluorescência direta para confirmação diagnóstica. Apresenta-se então, neste artigo, relato de caso ilustrando essa necessidade.

Linear immunoglobulin A bullous dermatosis (DbIgA) of adults is a rare autoimmune disease characterized by subepidermal blistering and linear deposits of immunoglobulin A (IgA) in the basement membrane zone (BMZ). Owing to the fact it presents clinical and histological aspects similar to other bullous dermatosis, mainly dermatitis herpetiformis and bullous pemphigoid, direct immunofluorescence is required to confirm diagnosis. In this article, we describe a case that illustrates this need.

Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in calf fecal samples by direct immunofluorescence assay / Detecção de oocistos de Cryptosporidium parvum em amostras fecais de bezerros pela reação de imunofluorescência direta

The aim of this study was to produce a conjugate containing anti-Cryptosporidium parvum polyclonal antibodies and standardize a Direct Immunofluorescence Assay (DIF) for detecting C. parvum oocysts in fecal samples from calves. In order to obtain anti-C. parvum polyclonal antibodies, two New Zealand rabbits were immunized with a purified solution of C. parvum oocysts and Freund's adjuvant. Purification of the immunoglobulin G (IgG) fraction was performed by means of precipitation in ammonium sulfate and chromatography using a DEAE-cellulose column. The anti-C. parvum polyclonal antibody titer was determined by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The rabbit anti-C. parvum IgG fraction was conjugated with fluorescein isothiocyanate and standardization of the DIF was performed using various dilutions of conjugate on slides positive for C. parvum oocysts. The cross-reactivity of the anti-C. parvum conjugate was tested using oocysts of Cryptosporidium serpentis, Cryptosporidium andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp., and Candida sp. An anti-C. parvum conjugate was successfully produced, thus allowing standardization of DIF for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples. Cross-reactivity of anti-C. parvum polyclonal antibodies with C. andersoni and C. serpentis was also observed.

O objetivo deste estudo foi produzir um conjugado contendo anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium parvum e padronizar a Reação de Imunofluorescência Direta (RID), para detecção de oocistos de C. parvum em amostras fecais de bezerros. Para produção de anticorpos policlonais anti-C. parvum, dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com uma solução purificada de oocistos de C. parvum e adjuvante de Freund. A purificação da fração de imunoglobulina G (IgG) foi realizada por meio de precipitação em sulfato de amônio e cromatografia em coluna de DEAE celulose. A titulação dos anticorpos policlonais anti-C. parvum foi determinada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). A fração IgG de coelho anti-C. parvum foi conjugada com isotiocianato de fluoresceína, e a padronização da RID foi feita utilizando-se várias diluições do conjugado, em lâminas positivas para C. parvum. Foi pesquisada também a presença de reatividade cruzada do conjugado anti-C. parvum com C. serpentis, C. andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.. A produção do conjugado anti-C. parvum foi bem sucedida, sendo possível a padronização da RID para detecção de oocistos em fezes. Foi também observada reatividade cruzada dos anticorpos policlonais anti-C. parvum, com C. andersoni e C. serpentis.

Production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and standardization of direct immunofluorescence for detecting oocysts in water / Produção de anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium e padronização da imunofluorescência direta para a detecção de oocistos na água

INTRODUCTION: The production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and its use in direct immunofluorescence assays to determine the presence of Cryptosporidium in water are described in the present work. METHODS: Two rabbits were immunized with soluble and particulate antigens from purified Cryptosporidium oocysts. The sera produced were prepared for immunoglobulin G extraction, which were then purified and conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC). Slides containing known amounts of oocysts were prepared to determine the sensitivity of the technique. To test the specificity, slides containing Giardia duodenalis cysts were prepared. RESULTS: The conjugate was successfully used in water samples experimentally contaminated with Cryptosporidium oocysts, and it was possible to detect up to five oocysts/spot, corresponding to contamination of 250 oocysts/mL. CONCLUSIONS: The three immunizations performed in the rabbits were enough to produce antibodies against Cryptosporidium, the standard direct immunofluorescence assay permitted the detection of five oocysts in 20 percent of the samples, and no cross-reaction with Giardia duodenalis cysts occurred.

INTRODUÇÃO: A produção de anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium e sua utilização na imunofluorescência para determinar a presença de Cryptosporidium em água são descritas no presente trabalho. MÉTODOS: Dois coelhos foram imunizados com antígeno solúvel e particulado provenientes de oocistos purificados de Cryptosporidium. O soro produzido foi preparado para a extração de imunoglobulinas G, que foram purificadas e conjugadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Lâminas contendo quantidades conhecidas de oocistos foram preparadas para determinar a sensibilidade da técnica. Para testar a especificidade foram preparadas lâminas contendo cistos de Giardia duodenalis. RESULTADOS: O conjugado foi usado com sucesso em amostras de água contaminadas experimentalmente com oocistos de Cryptosporidium, sendo capaz de detectar até cinco oocistos/spots que corresponde a uma contaminação de 250 oocistos/mL. CONCLUSÕES: As três imunizações realizadas nos coelhos foram suficientes para produção de anticorpos contra Cryptosporidium; a reação de imunofluorescência direta padronizada permitiu a detecção de cinco oocistos em 20 por cento das amostras; não houve reação cruzada com cistos de Giardia duodenalis.

Detection of several clostridia by a direct fluorescent antibody test in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues

Descreve-se a aplicabilidade de uma técnica de imunofluorescência direta, para o diagnóstico de mionecroses causadas por clostrídios, a partir de tecidos fixados em formol e incluídos em parafina. Essa técnica pode auxiliar no diagnóstico do carbúnculo sintomático e da gangrena gasosa, contribuindo para determinar a real prevalência dessas doenças no país