Comparison of senescence progression in mesenchymal cells from human umbilical cord walls measured by immunofluorescence and flow cytometry of p16 and p21 / Comparação da progressão da senescência em células mesenquimais de parede de cordão umbilical humano medida por imunofluorescência e citometria de fluxo de p16 e p21

ABSTRACT Objective To follow the expansion of mesenchymal stem cells from umbilical cords by two classic senescence markers, p16 (INK4A) and p21 (CDKN1A), using practical, fast, and less expensive methods than the gold standard Western blotting technique, to evaluate its applicability in the laboratory. Methods Mesenchymal stem cells from umbilical cords were isolated from Wharton's jelly and, after quality control, morphological and immunophenotypic characterization by flow cytometry, were expanded in culture until coming close to cell cycle arrest (replicative senescence). Results A comparison was made between young cells, at passage 5, and pre-senescent cells, at passage 10, evaluating the protein expression of the classic cell senescence markers p16 and p21, comparing the results obtained by Western blotting with those obtained by flow cytometry and indirect immunofluorescence. Conclusion Follow-up of cell cultures, through indirect p16 immunofluorescence, allows the identification of mesenchymal stem cells from umbilical cord cultures at risk of reaching replicative senescence.

RESUMO Objetivo Acompanhar a expansão de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical por dois marcadores clássicos de senescência, p16 (INK4A) e p21 (CDKN1A), usando métodos práticos, rápidos e com custo menor do que a técnica padrão-ouro de Western blotting, para avaliar sua aplicabilidade em laboratório. Métodos Células-tronco mesenquimais de cordão umbilical foram isoladas da geleia de Wharton e, após controle de qualidade e caracterização morfológica e imunofenotípica por citometria de fluxo, foram expandidas em cultura, até chegarem próximas à parada do ciclo celular (senescência replicativa). Resultados Foi feita a comparação entre células jovens, na passagem 5, e células pré-senescentes, na passagem 10, avaliando a expressão proteica dos marcadores clássicos de senescência celular p16 e p21, comparando os resultados obtidos por Western blotting com os obtidos por citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Conclusão O seguimento de culturas celulares, por meio da imunofluorescência indireta de p16, permite identificar as culturas de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical em risco de atingirem a senescência replicativa.

Frequency of polymorphisms and protein expression of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) in central nervous system tumors / Frequência dos polimorfismos e da expressão protéica do inibidor de quinase dependente de ciclina 1A (CDKN1A) em tumores do sistema nervoso central

Context and objective: Genetic investigation of central nervous system (CNS) tumors provides valuable information about the genes regulating proliferation, differentiation, angiogenesis, migration and apoptosis in the CNS. The aim of our study was to determine the prevalence of genetic polymorphisms (codon 31 and 3' untranslated region, 3'UTR) and protein expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) gene in patients with and without CNS tumors. Design and setting: Analytical cross-sectional study with a control group, at the Molecular Biology Laboratory, Pediatric Oncology Department, Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. Methods: 41 patients with CNS tumors and a control group of 161 subjects without cancer and paires for sex, age and ethnicity were genotyped using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Protein analysis was performed on 36 patients with CNS tumors, using the Western Blotting technique. Results: The frequencies of the heterozygote (Ser/Arg) and polymorphic homozygote (Arg/Arg) genotypes of codon 31 in the control subjects were 28.0 percent and 1.2 percent, respectively. However, the 3'UTR site presented frequencies of 24.2 percent (C/T) and 0.6 percent (T/T). These frequencies were not statistically different (P > 0.05) from those seen in the patients with CNS tumors (19.4 percent and 0.0 percent, codon 31; 15.8 percent and 2.6 percent, 3'UTR site). Regarding the protein expression in ependymomas, 66.67 percent did not express the protein CDKN1A. The results for medulloblastomas and astrocytomas were similar: neither of them expressed the protein (57.14 percent and 61.54 percent, respectively). Conclusion: No significant differences in protein expression patterns or polymorphisms of CDKN1A in relation to the three types of CNS tumors were observed among Brazilian subjects.

Contexto e objetivo: A investigação genética dos tumores do sistema nervoso central (SNC) provê valiosa informação sobre os genes que regulam a proliferação, diferenciação, angiogênese, migração e apoptose. O objetivo deste estudo é determinar a prevalência entre os polimorfismos genéticos (códon 31 e da região 3' não traduzida, 3'UTR) e a expressão protéica do gene inibidor de quinase dependente de ciclina 1A (CDKN1A) em pacientes com e sem tumor do SNC. Tipo de estudo e local: Estudo transversal analítico com grupo controle, desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Oncologia Pediátrica do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. Métodos: 41 pacientes com tumor do SNC e um grupo controle de 161 indivíduos sem câncer pareados por idade, sexo e etnia foram genotipados mediante uma reação de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). A análise das proteínas foi realizada em 36 pacientes com tumor de SNC mediante Western Blotting. Resultados: A frequência do genótipo heterozigoto (Ser/Arg) e do homozigoto polimórfico (Arg/Arg) do códon 31 nos controles foi 28,0 por cento e 1,2 por cento, respectivamente. Entretanto, o sítio 3'UTR apresentou uma frequência de 24,2 por cento (C/T) e 0,6 por cento (T/T). Estas frequências não são significativamente diferentes (P > 0,05) daquelas observadas no grupo dos pacientes com tumor de SNC (19,4 por cento e 0,0 por cento, códon 31; 15,8 por cento e 2,6 por cento, sítio 3'UTR). Com respeito à expressão protéica, nos ependimomas, 66,67 por cento não expressaram a proteína CDKN1A. Estes resultados foram similares entre os meduloblastomas e os astrocitomas, os quais não expressaram a proteína com 57,14 por cento e 61,54 por cento, respectivamente. Conclusão: Não foram encontradas diferenças significativas entre o padrão de expressão protéica, polimorfismos de CDKN1A e os três tipos de tumores de SNC em indivíduos brasileiros.