Estratégias para identificação e quantificação de aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) em cianobactérias e outros organismos para aplicação em cosmética e farmacêutica / Identification and quantification methods of mycosporine-like amino acids (MAAs) in cyanobacteria and other microorganisms for cosmetic and pharmaceutical application

Os aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos, produzidos por algumas espécies de cianobactérias e outros microorganismos, principalmente quando são expostos a radiação ultravioleta (UVR). Estes compostos, que vêm demonstrando funções fotoprotetoras e antioxidantes, têm sido pesquisados para aplicação em protetores solares e em produtos antienvelhecimento. O presente estudo focou na caracterização de cianobactérias e outros organismos quanto à produção de MAAs com potencial aplicação em cosméticos. Neste estudo foram desenvolvidos diversos métodos para identificação (via HPLC-DAD-MS/HRMS), purificação (via HPLC-DAD) e quantificação de MAAs (via LC-MS/MS). Pelo método de identificação de MAAs verificou-se que, das 75 cianobactérias estudadas, 27 cepas (38%) sintetizam MAAs. A cepa Oscilatoria sp. CMMA 1600 produziu a maior diversidade de MAAs. 10 MAAs diferentes foram identificados incluindo um MAA de massa molecular 316 Da. Através de dados espectroscópicos obtidos via HPLC-DAD-HRMS e RMN 1D e 2D confirmou-se que se tratava da micosporina-glicina-alanina. A biossíntese natural deste composto por cianobactérias foi relatada pela primeira vez neste estudo. Quanto à quantificação de MAAs, o protocolo de extração otimizado possibilitou uma excelente recuperação dos compostos de interesse, além de ser bastante simples e não utilizar solventes poluentes. As análises via LC-MS/MS foram realizadas através de experimentos de MRM em modo positivo usando uma coluna de fase reversa. O método validado permitiu determinar e quantificar com precisão os MAAs porphyra-334, shinorina e micosporina-glicina-alanina em corridas de apenas 6 minutos, com limites de deteção inferiores a 0,005 µg.mg -1. Aplicando o método de LC-MS/MS realizaram experimentos de indução de MAAs através de exposição à UVR tendo-se observado um aumento da concentração de MAAs nas cepas que já sintetizam estes compostos e, outras cepas começaram a produzir pelo menos um MAA. As cepas de S. torques-reginae (ITEP-024 e ITEP-026) produziram a maior concentração de MAAs. A cepa ITEP-024 foi ainda exposta a diferentes radiações tendo-se observado que a UVB é que mais influencia a produção de MAAs. Neste estudo foi demonstrado o potencial das cianobactérias como produtores de MAAs que podem ser utilizados como fotoprotores em protetores solares

Mycosporines and mycosporine-like amino acids (MAAs) are UV-absorbing compounds produced by cyanobacteria and other organisms, especially upon exposer to solar ultraviolet radiation (UVR). These compounds are photoprotective and some have additional antioxidant functíons useful to the natural cosmetics market. This study aims to identify MAAs-producing cyanobacteria with potential applicatíons in cosmetics. A HPLC-DAD-MS/HRMS method for the identification of MAAs was developed. Out of the 75 cyanobacteria studied, 27 strains (38%) synthesized MAAs. Oscilatoria sp. CMMA 1600, from homocyte type, produced the greatest diversity of MAAs. 10 different MAAs were identified including a MAA with molecular weight of 316 Da. The chemical structure of mycosporine-glycine-alanine was confirmed by 1D/2D NMR and HRMS analyses. This compound has never been reported from a natural source. In this study, a validated LC-MS/MS quantification method for MAAs is also presented. An easy-to-handle and rapid extraction procedure was developed which uses only water and volatile additives as the extractor solvents. The LC-MS/MS method was performed using multiple reaction monitoring in positive mode with a reverse-phase column. The method enabled the accurate determination and quantification of the MAAs porphyra-334, shinorine and mycosporine-glycine-alanine in a 6 minutes running time, with limits of detection < 0.005 µg.mg-1. MAAs induction experiments were performed through UVR exposure. MAAs are constitutively produced by some cyanobacteria and production was further enhanced following UVirradiance. Other strains start to produce at least one MAA after UV-irradiance. Sphaerospermopsis torques-reginae strain (ITEP-024 and ITEP-026) produced the highest concentration of these photoprotective compounds. S. torques-reginae ITEP 024 strain was further exposed to different radiation compositíons. MAAs were significantly influenced by UVB. In this study, the potential of cyanobacteria as MAA producers, that can be used as photoprotectors in sunscreens, has been demonstrated

Un método basado en la PCR para la identificación rápida de levaduras acumuladoras de astaxantina (Phaffia spp. ) / PCR-based method for the rapid identification of astaxanthin-accumulating yeasts (Phaffia spp.)

It has been recently found that the natural distribution, habitat, and genetic diversity of astaxanthin-producing yeasts (i.e. Phaffia rhodozyma, synonym Xanthophyllomyces dendrorhous) is much greater than previously thought. P. rhodozyma is biotechnologically exploited due to its ability to produce the carotenoid pigment astaxanthin and thus, it is used as a natural source of this pigment for aquaculture. P. rhodozyma was also capable of synthesizing the potent UVB sunscreen mycosporine-glutaminol-glucoside (MGG). Therefore, further environmental studies are needed to elucidate its ecological aspects and detect new potential strains for the production of astaxanthin and MGG. However, obtaining new isolates of P. rhodozyma and related species is not always easy due to its low abundance and the presence of other sympatric and pigmented yeasts. In this work we report a successful development of a species-specific primer which has the ability to quickly and accurately detecting isolates representing all known lineages of the genus Phaffia (including novel species of the genus) and excluding closely related taxa. For this purpose, a primer of 20 nucleotides (called PhR) was designed to be used in combination with universal primers ITS3 and NL4 in a multiplex amplification. The proposed method has the sensitivity and specificity required for the precise detection of new isolates, and therefore represents an important tool for the environmental search for novel astaxanthin-producing yeasts.

Recientemente, se ha encontrado que la distribución natural, el hábitat y la diversidad genética de levaduras productoras de astaxantina (p. ej., Phaffia rhodozyma, sinónimo Xanthophyllomyces dendrorhous) son mucho mayores de lo que se pensaba. P. rhodozyma se explota biotecnológicamente debido a su capacidad para producir el pigmento carotenoide astaxantina y, por lo tanto, se utiliza como una fuente natural de este pigmento para la acuicultura. También se encontró que esta levadura es capaz de sintetizar el potente protector solar UVB micosporina-glutaminol-glucósido (MGG). Por lo tanto, más estudios ambientales para dilucidar sus aspectos ecológicos y detectar nuevas cepas potenciales productoras de astaxantina y MGG son necesarios. Sin embargo, la obtención de nuevos aislamientos de P. rhodozyma y especies relacionadas no siempre es fácil debido a su baja abundancia y a la presencia de otras levaduras simpátricas y pigmentadas. En este trabajo se describe el desarrollo exitoso de un cebador especie-específico que tiene la capacidad de detectar rápidamente y con precisión cepas representativas de todos los linajes del género Phaffia previamente reportados (incluyendo nuevas especies del género) y excluir especies estrechamente relacionadas. Para ello, se diseñó un cebador de 20 nucleótidos (denominado PhR) para ser utilizado en combinación con los cebadores universales ITS3 y NL4 en una amplificación multiplex. El método propuesto tiene la sensibilidad y la especificidad requerida para la detección precisa de nuevos aislamientos y, por lo tanto, representa una importante herramienta para la búsqueda ambiental de nuevas levaduras productoras de astaxantina.