Inmunolocalización de Sonic hedgehog en el desarrollo embrio-fetal de ratones ( Mus musculus ) / Immunolocalization of Sonic hedgehog in embryo-fetal mouse ( Mus musculus ) development

Sonic hedgehog (Shh) es un morfógeno esencial para el desarrollo de diversas estructuras, tales como notocorda, placa del piso del tubo neural, miembros, entre otros. Se buscó determinar la inmunolocalización de Shh en embriones y fetos de ratón. Para ello, se eutanasiaron 10 ratones gestantes (Mus musculus) BALB/c, un grupo de 5 animales a los 12,5 días post-coito (dpc), y otro grupo a los 17,5 dpc. Los embriones y fetos obtenidos fueron fijados en formalina al 10 % tamponada en PBS e incluidos en paraplast. Se realizaron cortes transversales seriados. Se utilizó anticuerpo policlonal Shh (Santa Cruz Biotechnology, H-160, conejo), dilución 1:100. Se identificó y describió la inmunolocalización de las muestras marcadas positivamente. La expresión de Shh en los embriones de 12,5 dpc fue inmunopositiva en notocorda, placa del piso del tubo neural, precartílago de radio y ulna, y prácticamente todos los epitelios: bronquial, intestinal, vejiga y uretra. En la etapa fetal, a los 17,5 dpc la inmunopositividad desaparece en el cartílago a excepción de zonas de osificación, disminuye en la epidermis pero aparece en folículos pilosos. La mucosa intestinal se ha diferenciado en segmentos, mostrando una inmunotinción mayor a nivel de las vellosidades intestinales. Shh actúa en distintos estadios del periodo gestacional, siendo clave en la diferenciación de distintas estructuras. En etapas embrionaria, es vital en la formación del sistema nervioso, organogénesis y formación de miembros, por lo que su expresión se encuentra en estas zonas. Sin embargo, en la etapa fetal la expresión cambia a estructuras de mayor especialización como folículo piloso y vellosidades intestinales.

Sonic hedgehog (Shh) is an essential morphogen for the development of various structures, such as notochord, neural tube floor plate, limbs, among others. We sought to determine the immunolocalization of Shh in embryos and mouse fetuses. To do this, 10 pregnant mice (Mus musculus) BALB /c were euthanized, a group of 5 animals at 12.5 days postcoitus (dpc), and another group at 17.5 dpc. Embryos and fetuses obtained were fixed in 10 % formalin buffered in PBS and embedded in paraplast. Serial cross sections were made. Polyclonal antibody Shh (Santa Cruz Biotechnology, H-160, rabbit), dilution 1:100 was used. The immunolocalization of the positively labeled samples was identified and described. Shh expression in 12.5 dpc embryos was immunopositive in notochord, neural tube floor plate, radius precartilage and ulna, and practically all epithelia: bronchial, intestinal, bladder and urethra. In the fetal stage, at 17.5 dpc the immunopositivity disappears in the cartilage except for areas of ossification, decreases in the epidermis but appears in hair follicles. The intestinal mucosa has differentiated into segments, showing greater immunostaining at the level of the intestinal villi. Shh acts in different stages of the gestational period, being key in the differentiation of different structures. In embryonic stages, it is vital in the formation of the nervous system, organogenesis and formation of limbs, so its expression is found in these areas. However, in the fetal stage the expression changes to more specialized structures such as hair follicles and intestinal villi.

Interacciones epitelio-mesenquimáticas en el desarrollo testicular / Epithelial-mesenchymal transitions in the development of testis

RESUMEN: La espermatogénesis es un proceso continuo que se inicia durante el desarrollo embriofetal. Las relaciones auto, para y yuxtacrinas indican la interdependencia de las células intersticiales (de Leydig) con las células peritubulares (lamina propia) y células sustentaculares (de Sertoli). Ciertos morfógenos son fundamentales en este proceso. Las células sustentaculares son capaces de regular la diferenciación y función de las células peritubulares e intersticiales a través de la producción de IGF1, TGFA, TGFB y DHH. Las células peritubulares son capaces de producir P-Mod-S, regulando la diferenciación de las células sustentaculares, y a través de FGF2 y FGF9 modulan las transiciones epitelio-mesenquimática entre células sustentaculares y mesonefros. También remodelan la membrana basal del condón testicular y regulan la diferenciación y función de las células intersticiales por medio de IGF1, TGFA y TGFB. Las células intersticiales son las reponsables de la producción de testosterona e INSL3, influyendo en la diferenciación sexual masculina. Se plantea que provienen de células mesenquimales del epitelio celómico y mesonefros. Sin embargo, otros autores proponen su origen a partir de células de la cresta neural. Estas influyen a través de mecanismos paracrinos en la proliferación de las células sutentaculares por medio de activina A, teniendo como resultado la expansión del cordón testicular. Las interacciones entre las distintas poblaciones celulares a través de morfógenos inducen una transición epitelio-mesénquima fundamental en la formación y diferenciación de la gónada masculina.

SUMMARY: Spermatogenesis is a continuous process which starts during the embryo-fetal development. Auto, para and juxtacrine relations indicate the interdependence of the interstitial cells (Leydig) with the peritubular cells (lamina propria) and sustentacular cells (Sertoli). Certain morphogens are fundamental in this process. Sustentacular cells are able to regulate differentiation and function and peritubular interstitial cells through production of IGF1, TGFA, TGFB and DHH. Peritubular cells are able to produce P-Mod-S regulating differentiation sustentacular cells and through FGF2 and FGF9 modulate epithelial-mesenchymal transitions between sustentacular cells and mesonephros. They also remodel the basal membrane of the testicular condom and regulate the differentiation and function of the interstitial cells by means of IGF1, TGFA and TGFB. Interstitial cells are responsible for the production of testosterone and INSL3, influencing male sexual differentiation. It is suggested that they come from mesenchymal cells of the coelomic epithelium and mesonephros. However, other authors propose their origin from cells of the neural crest. These influence through paracrine mechanisms proliferation sutentaculares cells by activin A, resulting in the expansion of cord testicular. The interactions between the different cell populations through morphogens induce a fundamental epithelial-mesenchymal transition in the formation and differentiation of the male gonad.

Rol de la vitamina E en el tubo neural de embriones y fetos de ratón (Mus musculus) tratados con ácido valproico: estudio inmunohistoquímico de sonic hedgehog / Role of vitamin E in neural tube of mouse (Mus musculus) embryos and fetuses treated with valproic acid: immunohistochemical study of sonic hedgehog

Sonic hedgehog (SHH) es un morfógeno esencial para el desarrollo del tubo neural, miembros y somitos. Variaciones en su expresión pueden ocasionar alteraciones en el sistema nervioso. Esto lo producen teratógenos, como el ácido valproico (VPA), el cual aumenta las especies reactivas de oxígeno, pudiendo contrarrestarse con la administración de vitamina E (VE). Se buscó determinar la expresión de SHH en tubo neural y médula espinal en embriones y fetos de ratones expuestos a VPA, VPA + VE y VE. Se conformaron 8 grupos de ratones hembra (Mus musculus). A los 8 días post-coito (p.c.) se les administró a los grupos 1 y 5 suero fisiológico 0,3 ml; grupos 2 y 6 VPA 600 mg/kg; grupos 3 y 7 VPA 600 mg/kg + VE 200 UI/kg; grupos 4 y 8 VE 200 UI/kg, todos los tratamientos vía oral. A los 12 días p.c., se sacrificaron los grupos 1, 2, 3 y 4, y a los 17 días los restantes. Fueron fijados en solución Bouin e incluidos en paraplast. Se realizaron cortes transversales a nivel torácico. Se utilizó anticuerpo policlonal anti-SHH (Santa Cruz, H-160, conejo), dilución 1:100. Se describió la morfología de las muestras marcadas positivamente, se midió la densidad óptica integrada y porcentaje de área inmunoreactiva. La expresión de SHH fue inmunopositiva en notocorda y placa del piso del tubo neural solo en embriones de 12 días p.c. Los grupos tratados con VPA+VE y VE presentaron mayor intensidad inmunohistoquímica y porcentaje de área inmunoreactiva en comparación al grupo tratado con VPA (p 0,0001) en la placa del piso, siendo similar al grupo control. En la notocorda, la intensidad de inmunoreacción fue similar a lo demostrado en la placa del piso, con diferencias significativas (p 0,0001), pero el porcentaje de área no arrojó diferencias. Los grupos de 17 días de gestación resultaron negativos a la expresión de SHH. La vitamina E regula la expresión de SHH en tubo neural, atenuando así los efectos del VPA.

Sonic hedgehog (SHH) is an essential morphogen for the development of neural tube, members and somites. Variations in expression can cause abnormalities in the nervous system. This will produce teratogens, such as valproic acid (VPA), which increases the reactive oxygen species and can be counteracted with the administration of vitamin E (VE). We sought to determine the expression of SHH in the neural tube and spinal cord in mice embryos and fetuses exposed to VPA, VPA + VE and VE. For the study we used 8 groups of female mice (Mus musculus). At day 8 post-coitus (p.c.) the groups were administered as follows: groups 1 and 5,0.3ml saline; groups 2 and 6, VPA 600 mg/kg; groups 3 and 7, VPA 600 mg / kg + VE 200 IU/kg; groups 4 and 8, VE 200 IU/kg, all treatments were given orally. On the 12th day p.c., groups 1, 2, 3 and 4 were euthanized and the remaining groups at day 17. They were fixed in Bouin solution and included in paraplast; thoracic cross sections were performed, anti-SHH polyclonal antibody (Santa Cruz, H-160, rabbit) dilution 1:100 was used. We described morphology of the positively labeled samples and measured integrated optic density and percentage of immunoreactivearea.SHH expression was immunopositive in notochord and floor plate of the neural tube in embryos only 12 day p.c. In the groups treated with VPA + VE and VE immunohistochemistry showed greater intensity and percentage of immunoreactive area compared to those in the group treated with VPA (p0.0001) in the floor plate, being similar to the control group. In the notochord, immunoreaction intensity was similar to that shown in the floor plate, with significant differences (p 0.0001), but the percentage of area showed no differences. The groups at day 17 of gestation were negative for the expression of SHH. VE regulates expression of SHH in neural tube, thus attenuating the effects of VPA.

Morfógenos durante el desarrollo embrionario de vertebrados / Morphogens during embryonic development of vertebrates

Durante el desarrollo embrionario, las células de muchos tejidos se diferencian de acuerdo con la información de posición que se establece por las gradientes de concentración de morfógenos. Estas son moléculas de señalización secretadas en una región restringida de un tejido y se difunden lejos de su fuente para formar una gradiente de concentración. La molécula de un mismo morfógeno actúa generalmente en distintas etapas de desarrollo de un organismo y puede provocar reacciones muy diferentes en las células en función de su historia de diferenciación. Los morfógenos más conocidos son miembros del factor de crecimiento beta (TGF-b), Hedgehog (Hh), familias Wnt y los microRNAs.

During embryonic development, cells in many tissues differ according to the positional information that is set by the concentration of morphogen gradients. These are signaling molecules that are secreted in a restricted region of a tissue and diffuse away from their source forming a concentration gradient. Morphogens generally act at different development stages in an organism and cause different reactions in cells depending on their history of differentiation. The best known example of morphogens are members of growth factor beta (TGF-beta), Hedgehog(Hh), and Wnt families or microRNAs.

SHh activity and localization is regulated by perlecan

Proliferation and cell fate determination in the developing embryo are extrinsically regulated by multiple interactions among diverse secreted factors, such as Sonic Hedgehog (SHh), which act in a concentration-dependent manner. The fact that SHh is secreted as a lipid-modified protein suggests the existence of a mechanism to regulate its movement across embryonic fields. We have previously shown that heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) are required for SHh binding and signalling. However, it was not determined which specific HSPG was responsible for these functions. Here we evaluated the contribution of perlecan on SHh localization and activity. To understand the mechanism of action of perlecan at the cellular level, we studied the role of perlecan-SHh interaction in SHh activity using both cell culture and biochemical assays. Our findings show that perlecan is a crucial anchor and modulator of SHh activity acting as an extracellular positive regulator of SHh.