Regulación de la actividad enzimática de la NMNAT de Leishmania braziliensis por péptidos representativos de su extremo N-terminal / Regulation of the enzymatic activity of the NMNAT of Leishmania braziliensis by representative peptides derived from its N-terminus end / Regulação da atividade enzimática do NMNAT de Leishmania braziliensis por peptídeos representativos derivados de sua extremidade N-terminal

Resumen El parásito intracelular Leishmania braziliensis es el agente causal de la leishmaniasis cutánea, enfermedad endémica de zonas tropicales, cuyos tratamientos farmacológicos son tóxicos y para la cual no se dispone de una vacuna en la actualidad. Por esta razón, el estudio de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético del parásito es relevante dada su importancia para la supervivencia del mismo. En este estudio, utilizando como secuencia plantilla los primeros 18 residuos del extremo N-terminal de la proteína nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de L. braziliensis (Lb-NMNAT), se sintetizaron péptidos implementando la estrategia Fmoc/ tert-Butilo en una resina Rink amida MBHA. Los péptidos se purificaron por cromatografía en columna C18 y se caracterizaron mediante RP-HPLC. La proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT se expresó en células Escherichia coli M15 y se purificó parcialmente empleando cromatografía de afinidad a metales inmovilizados. De esta proteína se confirmó su actividad enzimática a través de ensayos enzimáticos directos analizados por RP-HPLC. Los péptidos sintetizados se utilizaron para evaluar su efecto sobre la actividad enzimática de la proteína 6xHisLb-NMNAT, observándose una modulación diferencial, lo cual resulta promisorio para el diseño de herramientas quimioterapéuticas basadas en la secuencia N-terminal de la proteína Lb-NMNAT.

Abstract The intracellular parasite Leishmania braziliensis is the etiological agent of cutaneous leishmaniasis, an endemic disease in the tropics, whose pharmacological treatments are toxic and for which there is currently no vaccine. For this reason, the study of proteins related to the energy metabolism of the parasite is relevant given its importance for its survival. In this study, based on the first 18 residues of the N-terminal end of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyl transferase protein from L. braziliensis (Lb-NMNAT) as a template, peptides were synthesized implementing the Fmoc/tert-Butyl strategy in a Rink amide MBHA resin. The peptides were purified by C18 column chromatography and characterized by RP-HPLC. The recombinant 6xHisLb-NMNAT protein was expressed in Escherichia coli M15 cells and partially purified using immobilized metal affinity chromatography. The enzymatic activity of the protein was confirmed through direct enzymatic assays analyzed by RP-HPLC. The synthesized peptides were used to evaluate their effect on the enzymatic activity of the 6xHisLb-NMNAT protein, observing a differential modulation, which is promising for the design of chemotherapeutic tools based on the N-terminal sequence of the Lb-NMNAT protein.

Resumo O parasita intracelular Leishmania braziliensis é o agente causador da leishmaniose tegumentar, doença endêmica nos trópicos, cujos tratamentos farmacológicos são tóxicos e para a qual não existe vacina atualmente. Por este motivo, o estudo de proteínas relacionadas ao metabolismo energético do parasita é relevante dada a sua importância para a sua sobrevivência. Neste estudo, usando os primeiros 18 resíduos da extremidade N-terminal da proteína adenilil transferase de nicotinamida/mononucleotídeo nicotinato de L. braziliensis (Lb-NMNAT) como uma sequência modelo, os peptídeos foram sintetizados implementando a estratégia Fmoc/tert-Butil em uma resina Rink amida MBHA. Os peptídeos foram purificados por cromatografia em coluna C18 e caracterizados por RP-HPLC. A proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT foi expressa em células de Escherichia coli M15 e parcialmente purificada usando cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Desta proteína, sua atividade enzimática foi confirmada por meio de ensaios enzimáticos diretos analisados por RP-HPLC. Os peptídeos sintetizados foram utilizados para avaliar seu efeito na atividade enzimática da proteína 6xHisLb-NMNAT, observando uma modulação diferencial, o que é promissor para o projeto de ferramentas quimioterápicas baseadas na sequência N-terminal da proteína Lb-NMNAT

Protein-protein interactions of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase of Leishmania braziliensis

BACKGROUND Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) plays a central role in energy metabolism and integrates cellular metabolism with signalling and gene expression. NAD biosynthesis depends on the enzyme nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT; EC: 2.7.7.1/18), in which converge the de novo and salvage pathways. OBJECTIVE The purpose of this study was to analyse the protein-protein interactions (PPI) of NMNAT of Leishmania braziliensis (LbNMNAT) in promastigotes. METHODS Transgenic lines of L. braziliensis promastigotes were established by transfection with the pSP72αneoαLbNMNAT-GFP vector. Soluble protein extracts were prepared, co-immunoprecipitation assays were performed, and the co-immunoprecipitates were analysed by mass spectrometry. Furthermore, bioinformatics tools such as network analysis were applied to generate a PPI network. FINDINGS Proteins involved in protein folding, redox homeostasis, and translation were found to interact with the LbNMNAT protein. The PPI network indicated enzymes of the nicotinate and nicotinamide metabolic routes, as well as RNA-binding proteins, the latter being the point of convergence between our experimental and computational results. MAIN CONCLUSION We constructed a model of PPI of LbNMNAT and showed its association with proteins involved in various functions such as protein folding, redox homeostasis, translation, and NAD synthesis.

SIRT3:a potential target for CHF? / 中国药理学与毒理学杂志

Pathological cardiac hypertrophy is a maladaptive response in a variety of organic heart disease(OHD),which is characterized by mitochondrial dysfunction that results from disturbed energy metabolism. SIRT3, a mitochondria-localized sirtuin, regulates global mitochondrial lysine acetylation and preserves mitochondrial function. However, the mechanisms by which SIRT3 regulates cardiac hypertrophy remains to be further elucidated. In this study, we firstly demonstrated that expression of SIRT3 was decreased in AngiotensionⅡ(AngⅡ)-treated cardiomyocytes and in hearts of AngⅡ-induced cardiac hypertrophic mice. In addition, SIRT3 overexpression protected myocytes from hypertrophy, whereas SIRT3 silencing exacerbated Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy.In particular,SIRT3-KO mice exhibited significant cardiac hypertrophy. Mechanistically, we identified NMNAT3 (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase 3), the rate-limiting enzyme for mitochondrial NAD biosynthesis, as a new target and binding partner of SIRT3.Specifically,SIRT3 physically interacts with and deacety-lates NMNAT3,thereby enhancing the enzyme activity of NMNAT3 and contributing to SIRT3-mediated anti-hypertrophic effects.Moreover,NMNAT3 regulates the activity of SIRT3 via synthesis of mitochon-dria NAD.Taken together,these findings provide mechanistic insights into the negative regulatory role of SIRT3 in cardiac hypertrophy.Sirtuin 3(SIRT3),a mitochondrial deacetylase that may play an impor-tant role in regulating cardiac function and a potential target for CHF

Structural insights into Plasmodium falciparum nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase: oligomeric assembly

The biochemical pathways involved in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis converge at the enzymatic step catalysed by nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC: 2.7.7.1). The majority of NMNATs are assembled into homo-oligomeric states that comprise 2-6 subunits. Recently, the NMNAT of Plasmodium falciparum (PfNMNAT) has been identified as a pharmacological target. The enzymatic characterisation, cellular location, and tertiary structure of the PfNMNAT protein have been reported. Nonetheless, its quaternary structure remains to be explored. The present study describes the oligomeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT recombinant protein using immobilised metal affinity chromatography coupled with size exclusion chromatography (SEC) and native protein electrophoresis combined with Ferguson plot graphing. These chromatographic approaches resulted in the elution of an active monomer from the SEC column, whereas the Ferguson plot indicated a dimeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT protein.

Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of Trypanosoma cruzi (TcNMNAT): a cytosol protein target for serine kinases

Nicotinamide/nicotinate adenine dinucleotide (NAD+/NaAD) performs essential functions in cell metabolism and energy production due to its redox properties. The nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) enzyme catalyses the key step in the biosynthesis of NAD+. Previously, the enzyme NMNAT was identified in Trypanosoma cruzi (TcNMNAT), a pathogenic agent with epidemiological importance in Latin America. To continue with the functional characterisation of this enzyme, its subcellular location and its possible post-translational modifications were examined in this study. For this, polyclonal antibodies were generated in mice, with soluble and denatured recombinant protein being used to detect the parasite’s NMNAT. Immunodetection assays were performed on whole extracts of T. cruzi, and an approximation of its intracellular location was determined using confocal microscopy on wild and transgenic parasites, which revealed the cytosol distribution patterns. This localisation occurs according to the needs of the dinucleotides that exist in this compartment. Additionally, a bioinformatics study was performed as a first approach to establish the post-translational modifications of the enzyme. Possible phosphorylation events were experimentally analysed by western blot, highlighting TcNMNAT as a potential target for serine kinases.

Producción y purificación de anticuerpos aviares (IgYs) a partir de cuerpos de inclusión de una proteína recombinante central en el metabolismo del NAD+ / Production and purification of avian antibodies (IgYs) from inclusion bodies of a recombinant protein central in NAD+ metabolisim / Produção e purificação de anticorpos aviários (IgYs) empregando os corpos de inclusão de uma proteína recombinante importante para o metabolismo do NAD+

El uso de gallinas para la producción de anticuerpos policlonales, reduce la intervención animal, obteniendo además una gran cantidad de anticuerpos. Las aves presentan mayor distancia filogenética entre sus antígenos y los de mamíferos ofreciendo altos porcentajes de anticuerpos específicos. La producción de anticuerpos requiere antígenos en cantidades considerables, por ello es creciente el uso de proteínas recombinantes para tales fines. No obstante, la obtención de proteínas en sistemas heterólogos conduce frecuentemente a la precipitación en agregados insolubles de limitada utilidad (cuerpos de inclusión). Este trabajo presenta una metodología para la producción de anticuerpos policlonales (IgYs) empleando cuerpos de inclusión (CI) como antígeno. Los CI purificados e inoculados corresponden a la Nicotinamida / Nicotinato Mononucleotido Adenililtranferasa (His-GiNMNAT) de Giardia intestinalis expresada en Escherichia coli. La purificación del antígeno se llevó a cabo mediante solubilización y renaturalización. Los anticuerpos se purificaron de la yema de huevo de gallinas imunizadas mediante dilución en agua, seguida de precipitación con sulfato de amonio al 60% y afinidad tiofilica. Los anticuerpos fueron evaluados mediante inmunoblot empleando la proteína His-GiNMNAT. De una yema de huevo se obtuvieron 14,4 mg de IgYs, con alta pureza y con un reconocimiento de hasta 15ng de His-GiNMNAT. Se mejoró la especificidad de los IgYs mediante una purificación adicional por afinidad al antígeno, lo cual permitiría su empleo para el reconocimiento de la proteína del parásito.

In contrast with other animal models, the use of hens for polyclonal antibodies production not only reduces animal intervention, but also increases the quantity of the obtained immunoglobulins. The phylogenetic distance between birds and mammals, leads to more specific avian antibodies than their mammalian counterparts. Since a large amount of antigen is required for avian antibody production, the use of recombinant proteins for this procedure has been growing faster over the last years. Nevertheless, recombinant protein production through heterologous systems, frequently leads to the formation of insoluble and useless aggregates (inclusion bodies, IC). This article presents a strategy to produce avian polyclonal antibodies (IgYs) from IC. In order to obtain the antigen, the Giardia intestinalis nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase recombinant protein (His-GiNMNAT) was expressed in Escherichia coli. The His-GiNMNAT protein was purified through IC solubilization and re-folding. The purified protein was use to immunize hens. The antibodies were purified from egg yolk by water dilution, followed by ammonium sulfate precipitation and thiophilic affinity chromatography. Specificity of the purified antibodies was tested against the His-GiNMNAT protein through Western blot essays. In terms of yield, 14.4 mg of highly pure IgYs were obtained from one egg yolk; these antibodies were able to detect 15 ng of antigen. IgYs specificity was improved by means of antigen affinity purification, allowing its implementation for endogenous detection of GiNMNAT protein in G. intestinalis.

A utilização de galinhas para a produção de anticorpos policlonais, diminui a intervenção sobre o animal e permite a geração de grandes quantidades de anticorpos. As aves têm maior distância filogenética entre os seus antígenos em comparação com os mamíferos, oferecendo altos porcentagens de anticorpos específicos. A produção de anticorpos requerem quantidades consideráveis de antigénio, por conseguinte, é comum a utilização de proteínas recombinantes para esta finalidade. No entanto, a produção de proteínas em sistemas heterólogos muitas vezes leva à precipitação em agregados insolúveis de utilidade limitada (corpos de inclusão). Este trabalho apresenta uma metodologia para a produção de anticorpos policlonais, utilizando proteína recombinante a partir de corpos de inclusão. O antígeno utilizado foi a proteína Nicotinamida / Nicotinato Mononucleótido Adenililtranferasa de Giardia intestinalis gerada em Escherichia coli (His-GiNMNAT). A purificação do antigénio foi feita por solubilização e renaturalização. Os anticorpos foram purificados a partir da gema de ovo de galinhas imunizadas pelo método de diluição em água, seguido de precipitação com sulfato de amónio (60%) e afinidade tiofilica. Os anticorpos foram avaliados por imunoblot utilizando a proteína His-GiNMNAT. De uma gema de ovo foram obtidos 14,4 mg de IgYs com pureza elevada. Estes anticorpos podem reconhecer até 15 ng de His-GiNMNAT. A especificidade dos IgYs foi reforçada por outra purificação por afinidade pelo antigénio. Isto irá permitir a sua utilização para o reconhecimento da proteína do parasita.

DISEÑO Y PRODUCCIÓN DE UNA HERRAMIENTA MOLECULAR PARA EL ESTUDIO DEL N-TERMINAL DE LA NICOTINAMIDA MONONUCLEÓTIDO ADENILIL TRANSFERASA (NMNAT) EN Leishmania braziliensis / DESIGN AND PRODUCTION OF A MOLECULAR TOOL TO STUDY OF N-TERMINAL NICOTINAMIDE MONONUCLEOTIDE ADENYLYL TRANSFERASE (NMNAT) IN Leishmania braziliensis / DESIGN E PRODUÇÃO DE UMA FERRAMENTA MOLECULAR PARA O ESTUDO DO TERMINALN DA NICOTINAMIDA CICLASE MONONUCLEÓTIDO TRANSFERASE (NMNAT) EM Leishmania braziliensis

Leishmania braziliensis es un parásito protozoario causante de la mayor parte de casos de leishmaniasis cutánea en al menos quince países del continente americano. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reportado que cerca de doce millones de personas están infectadas en el mundo y que este número aumenta cada año. Debido al delicado problema de salud pública derivado de la prevalencia de esta enfermedad se hace necesario el estudio del metabolismo de este parásito. En tal sentido se ha estudiado la proteína NMNAT de este parásito, la cual es una enzima central del metabolismo de todos los organismos al estar encargada de la síntesis del NAD+, un importante cofactor en reacciones redox de procesos centrales del metabolismo celular. En la NMNAT de L. braziliensis se ha encontrado una secuencia de 44 aminoácidos en el extremo N-terminal carente de homología con la proteína del hospedero. En este estudio se produjeron anticuerpos IgG específicos contra esta secuencia, utilizando como antígenos péptidos que contuvieran la secuencia mencionada. Los anticuerpos obtenidos mostraron un reconocimiento de la NMNAT recombinante de L. braziliensis mediante ensayo por western blot.

Leishmania braziliensis is a protozoan which is cause of the most of the cutaneous leishmaniasis cases in at least 15 countries from America. World Health Organization (WHO) has reported that around 12 millions of people are infected in the world and this number increase every year. Because of the delicate problem of public health due to the prevalence of this disease, it is necessary the metabolism study in this parasite. In this way has been studied NMNAT protein of the parasite, which is a central enzyme of the metabolism of all organisms, since it is in charge of synthesizing NAD+, an important cofactor in oxidation-reduction reactions of central processes in the cellular metabolism. In The NMNAT of L. has been found a 43 amino acids sequence in the N terminal, which does not have homology with the protein in the human host. In this study were produced IgG antibodies against this sequence, using like antigens peptides that had the mentioned sequence. The produced antibodies recognized the recombinant NMNAT of L. braziliensis through western blot assay.

Leishmania braziliensis é um parasita protozoário que causa a maioria dos casos de leishmaniose cutânea em pelo menos 15 países das Américas. A Organização Mundial de Saúde (OMS) informou que cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo e esse número aumenta a cada ano. Devido ao delicado problema de saúde pública decorrentes da prevalência desta doença é necessário estudar o metabolismo do parasita. A este respeito temos estudado a proteína NMNAT deste parasita, que é uma enzima central no metabolismo de todos os organismos de estar envolvido na produção de NAD+, um importante cofator em reações redox de processos centrais de celulares metabolismo. No L. braziliensis NMNAT encontrou uma seqüencia de 43 aminoácidos no terminal N homologia com a proteína faltando host. Este estudo produziu anticorpos IgG específicos para esta seqüência, usando como peptídeos de antígeno contendo a seqüência mencionada. Os anticorpos obtidos mostraram um reconhecimento da NMNAT L. braziliensis recombinantes por meio de julgamento por western blot.