Enfermedad granulomatosa crónica: fisiopatología genética y molecular. Pruebas diagnósticas vigentes / Chronic granulomatous disease: genetic and molecular pathophysiology. Effective diagnostic tests

Introducción: La enfermedad granulomatosa crónica es una inmunodeficiencia primaria congénita del sistema inmune innato, originada por defectos en el complejo enzimático nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa presente en células fagocíticas. Estos defectos funcionales causan incapacidad para producir especies reactivas del oxígeno en los fagocitos, que afectan la eliminación de algunos microorganismos patógenos dentro del fagolisosoma. El diagnóstico de esta enfermedad se realiza actualmente mediante la prueba de 1,2,3-dihidrorodamina asistida por citometría de flujo multiparamétrica, o la tinción de fagocitos con nitroazul de tetrazolio asistida por microscopio óptico. Objetivos: Describir los aspectos fisiopatológicos y moleculares de la enfermedad granulomatosa crónica; y discutir aspectos relacionados con las pruebas de diagnóstico antes mencionadas. Métodos: Se realizó una investigación bibliográfica-documental a partir de artículos científicos publicados desde 1933 hasta 2018, para ello fueron consultadas las bases de datos SciELO, PubMed y Springer. Desarrollo: Se exponen las características fisiopatológicas de la enfermedad granulomatosa crónica, así como la relación entre las mutaciones genéticas más abundantes en la población afectada y la gravedad de las manifestaciones clínicas que presentan los pacientes. Además, se analizan críticamente los beneficios y las deficiencias de dos técnicas que se utilizan actualmente para diagnosticar la enfermedad. Conclusiones: La enfermedad granulomatosa crónica puede generar consecuencias inmunológicas e inflamatorias graves, que se hallan en consonancia con las características genéticas expresadas en el complejo enzimático dañado. El diagnóstico de la enfermedad resulta más confiable, exhaustivo y específico, mediante la citometría de flujo y su prueba de 1,2,3-dihidrorodamina(AU)

Introduction: Chronic granulomatous disease is a congenital primary immunodeficiency of the innate immune system, caused by defects in the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase enzyme complex present in phagocytic cells. These functional defects cause inability to produce reactive oxygen species in phagocytes, affecting the elimination of some pathogenic microorganisms within the phagolysosome. The diagnosis of this disease is currently made by means of the 1,2,3-dihydrorodamine test assisted by multiparametric flow cytometry, or the staining of phagocytes with nitro-blue tetrazolium assisted by light microscopy. Objectives: To characterize molecular and pathophysiologically the chronic granulomatous disease; and to discuss aspects related to the aforementioned diagnostic tests. Methods: In this work, a bibliographic-documentary research was carried out from scientific articles published from 1933 to 2018, for which the SciELO, PubMed and Springer databases were consulted. Development: The pathophysiological characteristics of chronic granulomatous disease are exposed, as well as the relationship between the most abundant genetic mutations in the affected population, and the severity of the clinical manifestations presented by the patients. In addition, the benefits and deficiencies of two techniques currently used to diagnose the disease are critically analyzed. Conclusions: Chronic granulomatous disease can generate severe immunological and inflammatory consequences, which are in line with the genetic characteristics expressed in the damaged enzyme complex. The diagnosis of the disease is more reliable, exhaustive and specific, using flow cytometry and its 1,2,3-dihydrorodamine test(AU)

Efecto Regulador de Tibolona sobre la Actividad Antiinflamatoria del Macrófago / Regulatory Effect of Tibolone on Antiinflamatory Activity of Macrophage

Resumen Los macrófagos son células fagocíticas que activan a la sintasa de óxido nítrico (SON) y la NADPH oxidasa con el objetivo de eliminar agentes que reconocen como extraños. Además, participan en el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inflamatoria. Tibolona (Tb), a través de sus metabolitos, tiene actividad estrogénica, progestagénica y androgénica. Es utilizada como alternativa de la terapia hormonal de la menopausia, que además disminuye marcadores de inflamación. El objetivo de este estudio fue describir el efecto de Tb sobre la expresión de las interleucinas I, 6, 10 y TNF-α así como la actividad de la NADPH oxidasa del macrófago. Se utilizó la línea celular THP-1, se diferenció a macrófago, y se evaluó la actividad de NADPH oxidasa por el ensayo de NBT y la expresión de IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 por RT-qPCR. Se encontró que Tb regula la actividad enzimática, así como la expresión de citocinas ante un estímulo proinflamatorio. Por lo que se concluye que Tb favorece la actividad antiinflamatoria del macrófago. Estos resultados contribuyen a la descripción de los mecanismos de acción de este fármaco. Además, se propone al macrófago como un blanco de regulación del proceso inflamatorio por acción de Tb. Se sugiere que se determine la expresión proteica de las citocinas por otras técnicas, tales como western blot, ELISA, o citometría de flujo; así como la actividad de SON.

Abstract Macrophages are phagocytic cells that activate NOS and NADPH oxidase to eliminate agents that recognize like strangers, also participate in development and maintain of inflammatory response. In other hand, tibolone (Tb) has three main metabolites, which have an estrogenic, prostagenic and androgenic activity. This drug is a hormonal therapy to treat symptoms of menopause, with ability to decrease inflammation markers. The aim of this study is to describe the effect of Tb on macrophage activity. This study was carried out on differentiated macrophage THP-1 cell line used. NADPH oxidase activity by NBT assay and expression of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-10 by RT-qPCR were measured. It has been observed that Tb regulates the enzymatic activity, as well as the cytokines expression in the cells that received a proinflammatory stimulus; these results contribute to description of mechanism of action of this drug. The results suggest that macrophage could be a target for antiinflammatory action of Tb. Its remain to investagate the protein expression of cytokines and activity of iNOS.

Reconstitución inmune exitosa mediante trasplante de células madre hematopoyéticas en un paciente colombiano afectado con enfermedad granulomatosa crónica / Successful immune reconstitution by means of hematopoietic stem cell transplantation in a Colombian patient with chronic granulomatous disease

Introducción. La enfermedad granulomatosa crónica es una inmunodeficiencia primaria causada por mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del sistema de la oxidasa de NADPH ( Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate ) de las células fagocíticas, las cuales afectan la producción de especies reactivas del oxígeno y la actividad microbicida. Actualmente, la única terapia curativa para esta enfermedad es la reconstitución inmune mediante el trasplante de células madre hematopoyéticas. Objetivo. Reportar la caracterización clínica y molecular de un paciente con enfermedad granulomatosa crónica ligada al cromosoma X y su reconstitución inmunitaria exitosa mediante el trasplante de células madre hematopoyéticas. Materiales y métodos. El estallido respiratorio en neutrófilos de sangre periférica se midió por citometría de flujo mediante la prueba de oxidación de la dihidrorrodamina 123 (DHR 123). El análisis de las mutaciones del gen CYBB se hizo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el ADN complementario y la secuenciación e hibridación genómica comparativa en el ADN genómico. En el trasplante se emplearon células madre del hermano menor con HLA idéntico, y previamente se hizo un acondicionamiento de intensidad reducida. La reconstitución inmunitaria después del trasplante se evaluó periódicamente con hemoleucogramas y la prueba DHR 123 en neutrófilos de sangre periférica. Resultados. El diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica ligada al cromosoma X se estableció como resultado de una deleción hemicigota en la banda Xp21.1 que implicó la deleción completa del CYBB . La toma de injerto postrasplante para plaquetas y neutrófilos fue en los días 10 y 11, respectivamente. En el día 30 después del trasplante se logró la reconstitución hematológica completa y en los tres años siguientes no se observaron complicaciones ni infecciones. Conclusión. El trasplante de células madre hematopoyéticas permite la reconstitución completa de la función inmunitaria relacionada con la actividad microbicida de las células fagocíticas de pacientes con enfermedad granulomatosa crónica ligada al cromosoma X.

Introduction: Chronic granulomatous disease is a primary immunodeficiency that results from mutations in proteins of the NADPH oxidase system that affect the microbicidal activity of phagocytes. Immune reconstitution by hematopoietic stem cell transplantation is currently the only curative therapy for this disease. Objective: To describe the clinical and molecular characterization of a patient with X-linked chronic granulomatous disease and the successful immune reconstitution by means of a hematopoietic stem cell transplantation. Materials and methods: The respiratory burst was measured by flow cytometry using the dihydrorodamine 123 (DHR) oxidation test in neutrophils of peripheral blood. Mutational analysis of CYBB was performed by PCR amplification in complementary DNA, as well as sequencing and comparative genomic hybridization in genomic DNA. HLA-identical stem cells from the patient´s younger brother were used for the transplantation and reduced intensity pre-transplantation conditioning was administered. Post-transplantation immune reconstitution was evaluated periodically by serial complete blood counts and DHR 123 in peripheral blood neutrophils. Results: The diagnosis of X-linked chronic granulomatous disease resulted from a hemizygous deletion affecting Xp21.1 that included the entire CYBB . Post-transplantation engraftment was documented in platelets and peripheral blood neutrophils at days 10 and 11, respectively. Total hematological reconstitution was achieved by day 30 post-transplantation and no complications or infections have been observed in the three years since the transplantation. Conclusion: Hemopoietic stem cell transplantation allows for total reconstitution of the immune function related to microbicidal activity of phagocytic cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.

Caracterización clínica y genético-molecular de un paciente con enfermedad granulomatosa crónica ligada al X: reporte de una nueva mutación asociada al splicing: caso clínico / Clinical, genetic and molecular characterization of the X-linked chronic granulomatous disease: a case report of a new splicing mutation

Introducción: La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) se presenta como consecuencia de mutaciones en los genes que codifican 5 de las subunidades del sistema NADPH oxidasa humano. Su forma más común es causada por cambios en el gen CYBB que codifica gp91 phox. Objetivo: Identificar el defecto molecular que lleva a la presentación de la EGC. Caso clínico: Paciente de sexo masculino con antecedentes de enfermedad diarreica aguda y abscesos perianales recurrentes desde los 2 meses. A los 6 meses, presentó una inflamación crónica del colon y colitis bacteriana. A los 3 años tenía infecciones en las vías respiratorias inferiores y perianales. Estudio compatible con EGC. El análisis del ADNc identificó expresión anormal del ARNm, lo cual se confirmó al realizar la secuenciación. Específicamente se observó la ausencia del exón 2. Adicionalmente, los datos de la secuenciación del ADNg identificaron una alteración en el sitio aceptor de "splicing" del intrón 1, que incluye una deleción seguida de la inserción de 3 nucleótidos (c.46-14_-11delTTCT insGAA). Conclusiones: Se presenta el primer estudio molecular de un paciente con EGC por defecto de "splicing" reportado en Colombia. La definición de la mutación y su correlación con el fenotipo es importante para proveer una apropiada consejería genética al paciente y su familia.

Chronic granulomatous disease (CGD) is caused by mutations in the genes that encode five of the subunits of the human NADPH oxidase. The most common form is caused by mutations in CYBB, the human gene encoding gp 91 phox. Objective: To identify the molecular defects causing CGD. Case report: A male patient with a history of acute diarrhea and recurrent perianal abscess since two months old. At 6 months, the patient presented a chronic inflammatory disease of the colon and bacterial colitis. After three years, he developed infections in the lower and perianal respiratory tract. The cDNA analysis identified abnormal mRNA expression, which was confirmed by sequencing. Specifically the exclusion of exon 2 was observed. Additionally, gDNA sequencing identified an alteration in the acceptor splice site of intron 1, including a deletion followed by insertion of three nucleotides (c.46-14_-11delTTCT insGAA). Conclusions: The first molecular study of a patient with CGD due to splicing pattern change, reported in Colombia, is presented. The definition of the mutation and its correlation with the phenotype is essential to provide appropriate genetic counseling to patients and their families.

Sistema NADPH oxidasa: nuevos retos y perspectivas / NADPH oxidase system: new challenges and perspectives

El sistema NADPH oxidasa es un complejo multiproteico encargado de producir especies reactivas del oxígeno (ROS, por reactive oxygen species) en diferentes células y tejidos. Es de gran importancia en las células fagocíticas (principalmente neutrófilos y macrófagos) porque participa en la destrucción de microorganismos patógenos, mediante la fagocitosis y la formación de las trampas extracelulares de neutrófilos (NET, por neutrophils extracelular traps), así como en la activación de procesos inflamatorios. Las alteraciones en la producción de ROS por parte de las células fagocíticas a causa de defectos genéticos en los componentes del sistema generan la inmunodeficiencia primaria denominada enfermedad granulomatosa crónica (EGC). Este es un artículo de revisión sobre los componentes del sistema NADPH oxidasa, su distribución celular, mecanismo de activación y acción, así como de las funciones que desempeña en otros tejidos. Además, se revisan los defectos moleculares que llevan a la EGC y el tratamiento de esta, incluyendo la terapia con IFNγ, y finalmente las perspectivas para el estudio del sistema.

The NADPH oxidase system is a multiprotein complex that acts as the main source of reactive oxygen species (ROS) in different cells and tissues. In phagocytic cells (mainly macrophages and neutrophils) it is essential for eliminating pathogenic microorganisms, by phagocytosis and the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). It also contributes to inflammatory processes. Genetic defects in the components of the system cause alterations in the production of ROS by phagocytic cells, leading to the primary immunodeficiency known as chronic granulomatous disease (CGD). This is a review article on the components of the NADPH oxidase system, its cellular distribution, activation, mechanisms of action, and roles in other tissues. The different molecular defects that lead to EGC are also reviewed, as well as its treatment, including therapy with IFNγ, and the prospects for the study of the system.

Importancia de la terapia génica en la enfermedad granulomatosa crónica / Gene Therapy in chronic granulomatous disease

Reactive oxygen species (ROS) production by phagocytes is an important mechanism to kill invading microorganisms. Neutrophils from individuals with chronic granulomatous disease (CGD) do not produce ROS, thereby rendering these individuals more susceptible to infection. CGD results from mutations in the genes encoding essential subunits of respiratory burst NADPH oxidase, the enzyme complex necessary for the production of these reactive molecules. The absence of phagocyte ROS results in recurrent fungal and bacterial infections and inflammatory granulomas, associated with significant morbidity and mortality. Currently, the curative treatment is the allogenic bone marrow transplant (BMT); nevertheless, this therapy has some disadvantages including the HLA incompatibility, the immunosupression due to the myeloablative conditions necessary for the transplant and the high risk to develop graft vs. host disease. As an alternative to BMT the ex vivo gene therapy in hematopoietic stem cells has been intensely studied. Although this option could be the most appropriate treatment, it can give rise to other kinds of adverse effects. The genetic features of CGD have made it a very attractive candidate to be cured with gene therapy. This review summarizes and discusses the current advances about gene therapy and its application to CGD.

El sistema nadph oxidasa de las células fagocíticas es un complejo enzimático encargado de producir anión superóxido durante la respuesta contra los microorganismos. Mutaciones en los genes que codifican para las proteínas de este sistema son responsables de la Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) que es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por la presencia de infecciones recurrentes debidas a un grupo específico de microorganismos, principalmente oportunistas. Actualmente el tratamiento para la mayoría de los pacientes con EGC está dirigido a la prevención o al control de los procesos infecciosos, pero no a la curación de la enfermedad. El tratamiento curativo consiste en el trasplante alogénico de médula ósea (TMO); sin embargo, este método enfrenta dificultades como la incompatibilidad de HLA, la inmunosupresión debida a las condiciones mieloablativas necesarias para el trasplante y el riesgo de desarrollar la enfermedad injerto contra hospedero. Como una alternativa al TMO, ha surgido la terapia génica ex vivo en células progenitoras hematopoyéticas. Las características genéticas de la EGC le han permitido convertirse en un modelo para el estudio de la terapia génica ex vivo. En este artículo se describen y analizan los resultados que hasta la fecha se han obtenido en el campo de la terapia génica aplicada a la EGC.

Caracterización molecular en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica por deficiencia en p47 phox / Molecular characterization in patients with chronic granulomatous disease due to p47phox deficiency

El sistema NAOPH oxidasa es un complejo enzimático transportador de electrones localizado en la membrana de las células fagocíticas. De este sistema hacen parte varias proteínas; un flavocitocromo b558' el cual está conformado por una cadena b (gp91-phox) y una cadena a (p22-phox) y poral menos 3 proteínas citosólicas (p47-phox, p67- phox, p40-phox). Una alteración gen ética en cualquiera de estas proteínas causa el síndrome de Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC). La caracterización de las mutaciones de los pacientes con EGC ha sido fundamental para dilucidar la estructura y función de los componentes del sistema NAOPH oxidasa. En el caso de la p47-phox, se han obtenido hallazgos importantes que la hacen un modelo interesante para estudiar el mecanismo molecular involucrado en regular la expresión y función bioquímica de este sistema. En los pacientes con defecto en la p47-phox investigados hasta ahora, se ha hallado una deleción del dinucleótido GT al comienzo del exón 2 , siendo la mayoría de ellos homocigóticos para esta deleción, la cual posiblemente se debe a eventos de recombinación entre el gen p47 -phox normal y un seudogen recientemente descrito. En el diagnóstico de pacientes no homocigóticos, cualquier mutación encontrada en el análisis del ONA (gONA o cONA) puede representar un cambio sufrido por el seudogen. Por lo tanto, para la identificación precisa del defecto genético es necesario separar el gen normal del seudogen y analizar las secuencias en forma individual. Los pacientes no homocigóticos posiblemente deben tener una segunda mutación en el alelo tipo silvestre diferente a la deleción GT. De otro lado, a través de mutagénesis sitio-dirigida se pueden modificar algunos de los aminoácidos o dominios de la p47-phox, los cuales pueden ser esenciales para su funcionamiento y su relación con la EGC. Con esta metodología, es posible introducir cambios en un gen cuya secuencia es totalmente conocida, el cual es amplificado; las mutantes así generadas pueden dar información acerca de la estructura y función de los genes analizados, observando su efecto sobre la función. De esta manera se puede determinar lo importante que puede ser un cambio estructural en la función de esta proteína.

NADPH oxidase system is an enzymatic electron transport complex localized in the membrane of phagocytic cells. Several proteins belong to this system: A flavocytochrome b558, formed by a b chain (gp91.phox) and an a chain (p22.phox) and, at least, 3 cytosolic proteins (p47.phox, p67.phox and p40 phox). Genetic alteration in any of these proteins causes the syndrome of Chronic Granulomatous Disease (CGD). Characterization of mutations in patients with CGD has been fundamental to elucidate the structure and function of NADPH oxidase system ComponentS. Several findings make p47.phoX an interesting model to study the molecular mechanism involved in regulating the expreSSion and bioChemical function ofthis system. So far, in patients with p47.phoX defect a deletion of dinucleotide GT has been foUnd at the beginning of exon 2; most of them are homocygotic for this deletion which is probably due to recombinant events between normal p47.phoX gen and a recently described pseudogen. Any mutation found when diagnosing non.homocygotic patients (gDNA or cDNA) may represent a pseudogen change. Therefore, for precise identification of the genetic defect it is necessary to separate the normal gen from the pseudogen and to analyze individual sequences. Non.homocygotic patients posibly have a second mutation in the wild type allele different fron GT deletion. On the other hand, through site. oriented mutagenesis it is posible to modify some of the aminoacids or domains of p47.phoX, which may be essential for its function and relationship with CGD. With this method010gy it is possible to introduce changes in a gen whoSe sequence is thoroughly known and which is amplified; mutants So generated can give information concerning the structure and function of the analyzed genes, observing their effect on function. In this way the importance of a structural change on the function of a protein can be determined.