Neutropenia aloimune neonatal em gêmeas idênticas / Neonatal alloimmune neutropenia in identical twins

A neutropenia aloimune neonatal (NAN) é uma patologia causada pelo antagonismo imunológico, como a doença hemolítica do recém-nascido ou a trombocitopenia aloimune neonatal, mas relacionada aos neutrófilos, em vez de glóbulos vermelhos ou plaquetas. Descreveremos um caso clínico de duas gêmeas idênticas nascidas a termo, com Apgar de 8 e 9, sendo que após algumas horas do nascimento apresentaram febre. Um exame de sangue revelou neutropenia grave que resultou em sepse. O diagnóstico da NAN foi realizado clinicamente e por testes de histocompatibilidade. A prova cruzada por citometria de fluxo foi positiva, usando soro da mãe e suspensões celulares (granulócitos e linfócitos) das gêmeas e do pai. Este teste não fornece informações sobre para qual sistema genético os anticorpos foram positivos, se contra os antígenos específicos de neutrófilos humanos (HNA) ou contra os antígenos leucocitários humanos (HLA). Para o esclarecimento, realizamos o teste de aglutinação de granulócitos (GAT) com um painel de doadores fidelizados e com antígenos HNA1-5 conhecidos, utilizando o soro materno como reagente. Foi também realizada a pesquisa de anticorpos anti-HLA e anti-HNA no soro materno. Os genótipos HLA e HNA foram identificados, permitindo conhecer as especificidades dos anticorpos maternos contra os antígenos dos neutrófilos do marido e das filhas. O diagnóstico de NAN não é realizado na maioria dos hospitais de nosso país e do exterior, devido à dificuldade de execução dos testes de histocompatibilidade, no entanto a prova cruzada por citometria de fluxo pode facilmente ser implantada nos laboratórios clínicos, sendo que está descrita detalhadamente nesse caso clínico.

Neonatal alloimmune neutropenia (NAN) is a disease caused by immunological antagonism, such as hemolytic disease of the newborn or neonatal alloimmune thrombocytopenia, but related to neutrophils rather than to red blood cells or platelets. We will describe a clinical case of two identical twins born with Apgar 8 and 9 that started with fever few hours after delivery. A blood test revealed severe neutropenia, which was followed by sepsis. The diagnosis of NAN was done clinically and by histocompatibility testing. Flow cytometry crossmatch was positive, using mother serum and cell suspensions (granulocytes and lymphocytes) from the twin girls and from the father. This test did not provide information about the genetic system for which the antibodies are positive, if against human neutrophil antigens (HNA) or human leucocyte antigens (HLA). To clear this, the granulocyte agglutination test (GAT) was performed with a panel of control donors with known HNA1-5 antigens, using the maternal serum as a reagent. We did also a Luminex screening assay for detection of anti-HLA and anti-HNA antibodies in the mother serum. The HLA and HNA genotypes were identified, which allowed to define specificities in mother's antibodies against the neutrophil surface antigens from her husband and from the twins. The diagnosis of NAN diagnose is not done in most hospitals worldwide, mainly by the difficulty in executing the histocompatibility test. However, the crossmatch by flow cytometry could be easily done in clinical laboratories following the method described in this article.

Antioxidant effects of protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid in human neutrophils using a fluorescent substance / Efectos antioxidantes del ácido protocatéquico, ácido ferúlico y el ácido caféico usando una sustancia fluorescente en los neutrófilos humanos

Human neutrophils stimulated by phorbol myristate acetate (PMA), an activator of protein kinase C, produce active oxygen by NADPH oxidase in intracellular structures. We added succinimidyl ester of dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA), which first emits fluorescence when oxidized with active oxygen species, to neutrophils to produce active oxygen, in order to investigate the antioxidant effects of protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid which belong to polyphenols and are widely distributed among plants. Particularly, we focused on examining whether these substances capture and eliminate active oxygen inside or outside the neutrophil cytoplasm and whether these substances inhibit NADPH oxidase. Fluorescence microscopy demonstrated that fluorescence-positive intracellular structures were decreased in neutrophils when stimulated by PMA and exposed to an antioxidant. Quantitative measurement by flow cytometry revealed that the fluorescence intensities in neutrophils, exposed to protocatechuic acid, ferulic acid, or caffeic acid, were decreased by 62.9 percent, 71.4 percent, and 86.1 percent, respectively, as compared with those stimulated by PMA but not exposed to an antioxidant. Judging from fluorescence microscopy and dot blots by flow cytometry, these antioxidants had no effects on neutrophil morphology. On the other hand, the fluorescence intensities of the active oxygen released from neutrophils were decreased by 81.4 percent, 46.7 percent, and 27.4 percent, respectively. Diphenylene iodonium, a specific inhibitor of NADPH oxidase, inhibited the enzyme by 92.1 percent in the PMA-stimulated neutrophils. Protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid inhibited the enzyme by 36.5 percent, 54.6 percent, and 27.4 percent, respectively. These results demonstrate that protocatechuic acid, ferulic acid, and caffeic acid capture and eliminate active oxygen, produced by PMA-stimulated neutrophils, intracellularly and extracellularly. Furthe...

Los neutrófilos humanos estimulados por forbol-miristato-acetato (PMA), un activador de la proteína quinasa C, producen oxígeno activo por la NADPH oxidasa en las estructuras intracelulares. Hemos añadido diacetato de 2', 7-dihidro dicloro fluoresceína (H2DCFDA), que emite fluorescencia cuando se oxida con las especies de oxígeno activo, a neutrófilos para producir oxígeno activo, a fin de investigar el efecto antioxidante del ácido protocatéquico, el ácido ferúlico y el ácido cafeico que pertenecen a polifenoles y se distribuyen ampliamente entre las plantas. Particularmente, nos enfocamos en examinar si estas sustancias capturan y eliminan el oxígeno activo dentro o fuera del citoplasma de neutrófilos y si estas sustancias inhiben la NADPH oxidasa. La microscopia de fluorescencia demostró que las estructuras intracelulares positivas a fluorescencia disminuyeron en los neutrófilos mediante la estimulación de la PMA y exposición a un antioxidante. La medición cuantitativa por citometría de flujo reveló que la intensidad de fluorescencia en los neutrófilos, expuestos al ácido protocatéquico, el ácido ferúlico, o el ácido cafeico, se redujo un 62,9 por ciento, 71,4 por ciento y 86,1 por ciento, respectivamente, en comparación con las estimuladas por PMA pero no expuestas a un antioxidante. A juzgar desde la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo, estos antioxidantes no tuvieron efectos sobre la morfología de los neutrófilos. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia del oxígeno activo liberado por los neutrófilos se redujeron un 81,4 por ciento, 46,7 por ciento y 27,4 por ciento, respectivamente. El DPI (difenileno-iodonio), un inhibidor específico de la NADPH oxidasa, inhibió a la enzima en el 92,1 por ciento en los neutrófilos estimulados por PMA. El ácido protocatéquico, el ácido ferúlico y el ácido caféico inhiben la enzima en un 36,5 por ciento, 54,6 por ciento y 27,4 por ciento, respectivamente. Estos resultados demuestran...