Efecto de la degradación post mórtem sobre la detección inmunohistoquímica de antígenos en el cerebro de ratón / Effect of postmortem degradation on the immunohistochemical detection of antigens in the mouse brain

Introducción. Si bien lo ideal es llevar a cabo la preservación de los tejidos en el menor tiempo posible luego de la muerte de un animal objeto de un estudio neurohistoquímico, con frecuencia es inevitable trabajar con tejido nervioso obtenido varias horas post mórtem. Objetivo, Estudiar el efecto de la degradación post mórtem sobre la inmunorreacción de di-ferentes antígenos en el cerebro de ratón. Métodos. Se inocularon ratones con virus de la rabia y se extrajeron los cerebros luego de fijar los animales con paraformaldehído me-diante perfusión. En otro grupo de animales la extracción de los encéfalos se hizo para fi-jarlos por inmersión con el mismo fijador y en diferentes horas post mórtem. En un vibráto-mo se obtuvieron cortes coronales de los ce-rebros, y estos se procesaron para inmunode-tección de rabia y de otros cuatro antígenos. Resultados. Cuatro de los antígenos evalua-dos, calbindina, parvoalbúmina, glutamato y ácido gamma-aminobutírico (GABA), presen-taron pérdida de inmunorreacción cuando el tejido cerebral se había tratado previamente mediante fijación por inmersión. Este efecto fue más acentuado cuando aumentó el tiempo post mórtem antes de la fijación. Por el con-trario, la inmunorreacción al virus de la rabia se incrementó cuando transcurrieron más de seis horas post mórtem antes de la fijación. Conclusiones. La fijación por perfusión es ideal para estudios de inmunohistoquími-ca de diferentes antígenos. La degradación tisular post mórtem generalmente provoca disminución de la inmunorreacción. No obs-tante, los antígenos del virus de la rabia in-crementan su inmunorreacción a medida que transcurre el tiempo post mórtem antes de la fijación.

Introduction: It is advisable to carry out the preservation of tissues in the shortest time after the death of an animal subject of neu-rochemical study but it is often unavoidable to work with nervous tissue obtained several hours postmortem. Objective: To study the effect of postmor-tem degradation on immunoreactivity of di-fferent antigens in the mouse brain. Methods: Mice were inoculated with rabies virus and the brains were removed after the animals were fixed by perfusion with parafor-maldehyde. In another group of animals the brain extraction was performed and they were fixed by immersion in the same fixative solu-tion at different hours postmortem. Coronal sections of the brains were obtained in a vibra-tome and they were processed for immunode-tection of rabies, and other four antigens. Results: Four of the antigens studied, cal-bindin, parvalbumin, glutamate and GABA, showed loss of immunoreactivity when brain tissue was pretreated by immersion fixa-tion. This effect was more noticeable when postmortem time increase before the fixing. Conversely immunoreactivity to rabies virus was increased over six hours postmortem before fixation. Conclusions: Fixation by perfusion is ideal for immunohistochemical studies of diffe-rent antigens. Postmortem tissue degrada-tion usually causes decreased immunoreac-tivity. However, rabies virus antigens show increased immunoreactivity when elapses more postmortem time before fixation.

Evaluación inmunohistoquímica de la expresión de calbindina en el cerebro de ratones en diferentes tiempos después de la inoculación con el virus de la rabia / Immunohistochemical evaluation of calbindin expression in mouse brain at different times after rabies virus inoculation

Introducción: La calbindina (CB) es una proteína reguladora del metabolismo del calcio intracelular. Previamente se demostró que la infección con virus fijo de la rabia induce pérdida de la expresión de CB, en el cerebro de ratones en estado terminal de la enfermedad, a los 7-8 días de post-inoculación (p.i.) intramuscular. Objetivo: Determinar si la pérdida de expresión de CB se presenta también en etapas tempranas de la infección y si es una consecuencia inmediata a la aparición de antígenos virales en el cerebro. Materiales y métodos: Se inocularon ratones con virus fijo de la rabia, por vía intramuscular, en su extremidad posterior izquierda. Diariamente se tomaron entre 4 y 6 animales infectados y sus respectivos controles, se fijaron por perfusión intracardíaca con paraformaldehído, se extrajeron sus cerebros y se obtuvieron cortes coronales en un vibratomo. Estos se sometieron a reacciones inmunohistoquímicas para evaluar la presencia de antígenos virales y la expresión de CB. Esta última fue cuantificada mediante densitometría óptica en un microscopio con anßlisis de imßgenes. Resultados: La inmunorreactividad a la rabia fue positiva en el cerebro a partir del día 3 p.i.; se observó primero en neuronas piramidales de la corteza frontal. La inmunotinción para CB no sufrió ninguna alteración cualitativa ni cuantitativa en la corteza cerebral y el estriado hasta el día 6 p.i. Conclusiones: Estos resultados coinciden con los de otros estudios sobre la rabia en los que se han encontrado alteraciones moleculares, metabólicas o fisiopatológicas en el sistema nervioso sólo en la fase terminal de la enfermedad.

Introduction: The calcium-binding protein calbindin (CB) plays a critical role in intracellular calcium metabolism. In a previous study we demonstrated that the infection with fixed rabies virus caused loss of CB expression in mouse brain during terminal state of the disease, 7-8 days after intramuscular inoculation. Objectives: To determine loss of CB expression also appears in early stages of the infection and if it is a consequence immediate to the appearance of viral antigens in the brain. Materials and methods: Mice were inoculated with fixed rabies virus, by intramuscular route, in the left hind limbs. Daily, to sixth day, 4-6 animals and their respective controls were killed and fixed by intracardiac perfusion with paraformaldehyde and their brains were extracted to obtain coronal sections using a vibratome. Free-floating sections were treated by immunohistochemical procedures to evaluate the presence of rabies viral antigens and the expression of CB. The last one was quantified by optical densitometry in a microscope with a system of image analysis. Results: Rabies immunoreactivity was observed in the brain three days after virus inoculation, beginning in pyramidal neurons of the frontal cortex whereas the immunostaining for CB did not undergo any qualitative nor quantitative changes neither in the cerebral cortex or striatum during the six days post-inoculation. Conclusions: These results agree with other studies in which it has been settled down that the rabies molecular or metabolic effects on the nervous system are well-known only in the final stage of the disease.