RESUMEN
El ministerio de salud tiene como una de las prioridades en investigación a las enfermedades infecciosas, entre las que incluye a las leishmaniasis y la tripanosomiasis americana. En la Facultad Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas se estudian especies vegetales medicinales utilizadas por la cultura Tacana como fuente de agentes antiparasitarios potenciales. Los laboratorios dedicados al descubrimiento de moléculas naturales con actividad antiparasitaria, tienen el desafío de desarrollar protocolos que permitan detectar biomoléculas selectivas, efectivas y menos tóxicas que las disponibles. Por ende, las evaluaciones antiparasitarias in vitro (CI50), deberían ir acompañadas de evaluaciones de citotoxicidad (DL50), con el fin de calcular un Índice de Selectividad (IS=DL50 / CI50) como parámetro de especificidad biológica. La citotoxicidad fue medida sobre líneas de macrófagos (RAW 264.7, murino), células involucradas en las infecciones por parásitos intracelulares. El protocolo fluorométrico parte con una población de 5x104 células/mL, incubada a 37ºC en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium), por 96 horas, con adición de resazurina (2mM) 3 horas antes de las lecturas finales. Bajo estas condiciones se evaluó la citotoxicidad de drogas control y 15 extractos vegetales seleccionados por su actividad anti-kinetoplastida. El extracto de Cosmailu fue el más citotóxico, Ejije bid'u resultó selectivo para T. cruzi y Leishmania amazonensis, mientras que Id'ene eidhue, fue selectivo para L. amazonensis. Finalmente, los otros 12 extractos resultaron ser poco selectivos o citotóxicos.
The Ministry of Health has infectious diseases as one of the research priorities, including leishmaniasis and American trypanosomiasis. The Faculty of Pharmaceutical and Biochemical Sciences develops evaluations of medicinal plant species used by the Tacana culture as a source of potential antiparasitic agents. Laboratories dedicated to the discovery of natural molecules with antiparasitic activity, have the challenge of developing protocols that allow the detection of selective, effective and less toxic biomolecules than those available. Therefore, in vitro antiparasitic evaluations (IC50) should be accompanied by cytotoxicity evaluations (LD50), in order to calculate a Selectivity Index (IS = LD50/ IC50) as a parameter of biological specificity. The cytotoxicity was measured on macrophage line (RAW 264.7, murine), cells engaged on intracellular parasites infections. The fluorometric protocol starts with an initial population of 5x104 cells/mL, incubated at 37ºC, in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) for 96 hours with addition of resazurin (2mM) 3 hours, before final readings. Under these conditions the cytotoxicity of control drugs and 15 plant extracts, selected by their anti-kinetoplastid activity, was evaluated. Cosumailu extract was the most cytotoxic, Ejije bid'u was selective for T. cruzi, and Leishmania amazonensis, while Id'ene eidhue, was selective for L. amazonensis. Finally, the other 12 extracts were little selective or cytotoxic.
Asunto(s)
Plantas Medicinales , Preparaciones Farmacéuticas , Leishmaniasis , Enfermedades Parasitarias , Extractos Vegetales , DiagnósticoRESUMEN
Para efetivamente tratar uma infecção, é necessário que o antibiótico possua atividade antimicrobiana adequada e seja capaz de inibir o crescimento do microrganismo patogênico. O doseamento microbiológico é uma metodologia indicada para a análise do antimicrobiano de forma simples, quando comparado com outras metodologias. A Food and Drug Administration (FDA) tem encorajado uma abordagem proativa para introduzir inovações e benefícios associados ao processo de produção farmacêutica. A Qualidade por Design Analítico (AQbD) ajuda no desenvolvimento de métodos analíticos robustos e de baixo custo, que são aplicáveis durante todo ciclo de vida do produto. Os métodos microbiológicos tradicionais, de forma geral, apresentam baixa reprodutibilidade e alta incerteza. Desta forma, justifica-se o desenvolvimento de métodos microbiológicos alternativos para a análise de antimicrobianos empregando-se os conceitos de Qualidade por Design Analítico, com a finalidade de melhorar a reprodutibilidade e reduzir a incerteza final. O objetivo deste trabalho foi aplicar o conceito de Qualidade por Design Analítico (AQbD) no desenvolvimento de método colorimétrico para análise de sulfato de neomicina. O sulfato de neomicina é um antimicrobiano aminoglicosídeo amplamente empregado no tratamento de infecções cutâneas ou mucosas, tais como queimaduras, úlceras, e dermatites infecciosas. Métodos cromatográficos como a cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, de pareamento iônico ou cromatografia iônica com derivatização (pré ou pós-coluna) são utilizados para a análise de aminoglicosídeos, inclusive sulfato de neomicina. Contudo, de acordo com as farmacopeias, o método microbiológico é o método analítico de escolha para a análise de sulfato de neomicina e outros aminoglicosídeos. A análise colorimétrica é um método amplamente utilizado para a detecção e quantificação de diferentes substâncias, incluindo o crescimento microbiano em estudos de eficácia terapêutica. Neste trabalho, propomos o uso de resazurina como marcador colorimétrico. O indicador sofre uma reação de oxido-redução na qual altera a coloração em resposta à redução química resultante do crescimento celular. O uso de microplacas para a análise colorimétrica é uma alternativa ao método realizado em tubos de ensaio. Uma alternativa ao uso de espectrofotômetros para a análise colorimétrica é o uso de aparelhos smartphones, pois são equipados com CPUs rápidas, câmeras de alta resolução e sensores de imagem. O processamento da imagem captada pela câmera do dispositivo é utilizado como um analisador colorimétrico. Portanto, a aplicação dos conceitos de Qualidade por Design Analítico (AQbD) possibilitou o desenvolvimento racional de método microbiológico colorimétrico para análise de sulfato de neomicina
o effectively treat an infection, the antibiotic must have adequate antimicrobial activity and be capable of inhibiting the growth of the pathogenic microorganism. The microbiological assay is an indicated methodology for the analysis of the antimicrobial in a simple way, when compared with other methodologies. The Food and Drug Administration (FDA) has encouraged a proactive approach to introducing innovations and benefits associated with the pharmaceutical production process. Analytical Design Quality (AQbD) assists in the development of robust, low cost analytical methods that are applicable throughout the product life cycle. Traditional microbiological methods, in general, have low reproducibility and high uncertainty. Thus, it is justified the development of alternative microbiological methods for the analysis of antimicrobials using the concepts of Quality by Analytical Design, in order to improve reproducibility and reduce final uncertainty. The objective of this work was to apply the concept of Quality by Analytical Design (AQbD) in the development of a colorimetric method for the analysis of neomycin sulfate. Neomycin Sulfate is an aminoglycoside antimicrobial widely used in the treatment of cutaneous or mucosal infections, such as burns, ulcers, and infectious dermatitis. Chromatographic methods such as reverse phase high performance liquid chromatography, ion-pairing or ion chromatography with derivatization (pre or post-column) are used for the analysis of aminoglycosides, including neomycin sulfate. However, according to pharmacopoeias, the microbiological method is the analytical method of choice for the analysis of neomycin sulphate and other aminoglycosides. Colorimetric analysis is a widely used method for the detection and quantification of different substances, including microbial growth in studies of therapeutic efficacy. In this work, we propose the use of resazurin as a colorimetric marker. The indicator undergoes an oxidation-reduction reaction in which it alters the coloration in response to the chemical reduction resulting from cell growth. The use of microplates for colorimetric analysis is an alternative to the method carried out in test tubes. An alternative to the use of spectrophotometers for colorimetric analysis is the use of smartphones because they are equipped with fast CPUs, high resolution cameras and image sensors. The image processing captured by the device's camera is used as a colorimetric analyzer. Therefore, the application of the concepts of Quality by Analytical Design (AQbD) allowed the rational development of a microbiological colorimetric method for analysis of neomycin sulfate
Asunto(s)
Neomicina/clasificación , Colorimetría/instrumentación , Métodos de Análisis de Laboratorio y de Campo/análisis , Antiinfecciosos/efectos adversos , AntibacterianosRESUMEN
ABSTRACT The permanent investigation of new antimycobacterial drugs is necessary for the eradication programs of tuberculosis and other mycobacterium-related diseases. The aim of the present study is to search for new sources of antimycobacterial drugs using plant materials. In this study, 11 plant materials (extracts, essential oils and some fractions) obtained from 4 species of medicinal plants traditionally used as general therapeutics for different illnesses and specifically as treatment of tuberculosis, were evaluated using the microplate resazurin assay against 2 species of the Mycobacterium tuberculosis Complex and 3 nontuberculous mycobacteria. The results showed the hexane extract and the essential oil from fruits of Pterodonemarginatus (Vogel) as potential sources of antimycobacterial drugs against 4 species of tested mycobacteria. The hexane fraction of methanol extract from leaves of Centella asiatica also presented significant mycobacterial growth inhibition, but against M. chelonae only. In conclusion, it was possible to contribute to the antimycobacterial investigations by presenting three new samples of plants with significant antimicrobial activity against four Mycobacteriumspp and suggest future studies about the antimycobacterial properties of fruits from P. emarginatus.
RESUMO A investigação permanente de novas drogas antimicobacterianas é necessária no programa de erradicação da tuberculose e de outras doenças relacionadas com micobactérias. O objetivo deste estudo foi buscar novas fontes de drogas antimicobacterianas usando material vegetal. Neste estudo, 11 materiais de base vegetal (extratos, óleos essenciais e algumas frações) foram avaliados contra 5 espécies de micobactérias. Estes materiais foram obtidos a partir de 4 espécies de plantas medicinais tradicionalmente utilizadas como terapêutica geral para diferentes doenças e, especificamente, no tratamento de tuberculose (Baccharis dracunculifolia, Centella asiatica, Lantana camara, Pterodon emarginatus). Os ensaios foram realizados em microplacas com resazurina contra duas espécies do Complexo Mycobacteriumtuberculosis e 3 espécies de micobactérias não tuberculosas. Os resultados mostraram o extrato hexânico e o óleo essencial de frutos de P.emarginatus como potenciais fontes para drogas antimicobacterianas contra quatro espécies de micobactérias testadas. A fração hexânica do extrato metanólico das folhas de C. asiatica também apresentou significativa inibição do crescimento de micobactérias apenas contra M.chelonae. Em conclusão, foi possível contribuir para as investigações de antimicobacterianos por apresentar três novas amostras de plantas com atividade antimicrobiana significativa contra quatro Mycobacterium spp e sugerir a realização de estudos futuros sobre as propriedades antimicobacterianas de frutos de P. emarginatus.
Asunto(s)
/clasificación , Baccharis/clasificación , Lantana/clasificación , Antiinfecciosos/farmacología , Plantas , Micobacterias no TuberculosasRESUMEN
Se realizó un estudio comparativo de los métodos de resazurina y MTT como indicadores de medida indirecta de sobrevivencia celular, aplicables para la estimación de actividad citotóxica, con el fin de establecer la idoneidad de cada uno de los dos sistemas de detección, a través de la valoración de citotoxicidad sobre tres líneas celulares derivadas de tumores humanos: HEp-2, HT-29 y HeLa, evaluando tres compuestos sintéticos durante un periodo de tratamiento de 48 horas, usando como referencia de actividad Doxorrubicina HCl, un agente antineoplásico. Los resultados obtenidos por los dos métodos revelaron comportamientos semejantes en las condiciones estudiadas en las líneas celulares.
A study was carried comparing the resazurina and MTT methods as indicators of indirect measure of cellular survival applied to valuated cytotoxic activity in order to assess the suitability of each of the two detection systems. The comparison was made through the valuation of cytotoxicity on three cell lines derived from human tumors: HEp-2, HT-29 and HeLa, evaluating three synthetic compounds during a treatment period of 48 hours using as a reference activity Doxorubicin HCl. The results obtained by the two methods showed a similar performance under the conditions tested in cell lines.
RESUMEN
En la estimación de la posible citotoxicidad de extractos o compuestos en proceso de prospección se emplean métodos de tinción celular como aproximación indirecta para la medición masa celular viable. En ensayos de citotoxicidad sobre las líneas celulares SiHa, MCF-7 y MKN-45 se comparan el método de tinción sulforodamina B (SRB), que es un ensayo de tipo terminal, con el uso de resazurina propuesta como poco tóxica para las células. La comparación de los métodos se hizo en términos de porcentaje de supervivencia donde se evaluó la sensibilidad de las líneas a tres compuestos sintéticos durante un periodo de tratamiento de 48 horas usando como referencia de actividad doxorrubicina HCl, un medicamento empleando en cáncer. Los datos obtenidos en los dos tipos de ensayos sometidos a una prueba de correlación mostraron que no hay diferencias significativas en ambos métodos permitiendo la comparación entre estos bajo las condiciones usadas.
Cell staining methods are commonly used for estimating extracts or compounds potential cytotoxic activity when prospecting for indirect quantitative measurement of cell growth and viability. This work compared the sulphorhodamine B (SRB) staining method, which is a terminal cell density measuring assay, and the resazurin method, a cell proliferation assay which is supposed to be less toxic for the cell. The methods were compared in terms of percentage survival by evaluating MCF-7, MKN-45 and SiHa cell line sensitivity to three synthetic compounds using a 48-hour treatment period and doxorubicin HCl (a drug used in cancer treatment) as reference activity. A correlation test using the data obtained from the assays showed that there was no significant difference between the methods in the conditions used here.