Estudo estrutural e comparativo entre Sirtuínas 2 de diferentes espécies de Leishmania / Structural and comparative study between Sirtuins 2 of different species of Leishmania by means of Comparative Modeling and Molecular Dynamic

As leishmanioses são doenças negligenciadas que afetam mais de um bilhão e meio de pessoas ao redor do mundo, principalmente nos países em desenvolvimento, provocando grandes impactos socioeconômicos. Os fármacos disponíveis para o tratamento dessas doenças são ineficazes e apresentam graves efeitos adversos. O processo de pesquisa de novos fármacos envolve, entre outras coisas, a seleção de alvos bioquímicos essenciais para a sobrevivência e desenvolvimento do agente causador. Neste sentido, a Sirtuína 2, uma enzima epigenética com atividade hidrolase essencial para a sobrevivência dos parasitas do gênero Leishmania se apresenta como um alvo validado na busca de novos fármacos contra essas parasitoses. O planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor requer o conhecimento da estrutura tridimensional da proteína alvo. Desta forma, a elucidação estrutural e um estudo minucioso das Sirtuínas das várias espécies do gênero Leishmania apresenta-se como uma importante abordagem na aplicação desta estratégia na busca por agentes quimioterápicos. Até o momento, na família Trypanosomatidae, a única estrutura tridimensional resolvida experimentalmente de uma enzima Sirtuína 2 é a da espécie L. infantum. Assim, este trabalho aplicou a abordagem de Modelagem Comparativa utilizando o software Modeller na construção de modelos da Sir2rp1 das espécies L. infantum, L. major e L. braziliensis, cujas sequências de aminoácidos foram extraídas do banco de dados UNIProt. Os modelos construídos foram validados por meio da função de escore DOPE do Modeller e dos servidores PROCHECK, MolProbity e QMEAN, avaliando sua qualidade estereoquímica e seu enovelamento. Os ligantes naturais da enzima foram sobrepostos nos modelos construídos por alinhamento estrutural utilizando o software PyMol e os complexos validados foram submetidos a simulações de Dinâmica Molecular através do pacote GROMACS. Os complexos refinados foram então analisados por meio dos softwares PyMol e LigPlotPlus e dos pacotes GROMACS e gmx_MMPBSA, e foram estudados os sítios de ligação dos substratos e os resíduos de aminoácidos relevantes envolvidos em sua ligação e reconhecimento. A Modelagem Comparativa da Sirtuína 2 humana e seus homólogos das espécies L. infantum, L. major e L. braziliensis, as simulações de Dinâmica Molecular realizadas com os modelos enzimáticos construídos e validados complexados com seus ligantes naturais, os cálculos de energia de interação entre os modelos e seus substratos e o estudo estrutural comparativo realizado entre eles nos fornecem uma base teórica para a busca de novos inibidores da Sirtuína 2 que sejam mais seletivos e potentes contra as enzimas parasitárias, abrindo caminho para o desenvolvimento de candidatos a fármacos leishmanicidas mais seguros e eficazes

Leishmaniasis are neglected diseases that affect more than one and a half billion people around the world, mainly in developing countries, causing major socioeconomic impacts. The drugs available for the treatment of these diseases are ineffective and have serious adverse effects. The process of researching new drugs involves, among other things, the selection of biochemical targets essential for the survival and development of the causative agent. In this sense, Sirtuin 2, an epigenetic enzyme with hydrolase activity essential for the survival of parasites of the Leishmania genus, presents itself as a validated target in the search for new drugs against these parasites. Structure-Based Drug Design requires knowledge of the three-dimensional structure of the target protein. In this way, structural elucidation and a detailed study of Sirtuins from various species of the genus Leishmania presents itself as an important approach in the application of this strategy in the search for chemotherapeutic agents. To date, in the Trypanosomatidae family, the only experimentally resolved three-dimensional structure of a Sirtuin 2 enzyme is that of the species L. infantum. Thus, this work applied the Comparative Modeling approach using the Modeller software in the construction of Sir2rp1 models of the species L. infantum, L. major and L. braziliensis, whose amino acid sequences were retrieved from the UNIProt database. The constructed models were validated using Modeller's DOPE score function and the PROCHECK, MolProbity and QMEAN servers, evaluating their stereochemical quality and folding. The enzyme's natural ligands were superimposed on the built models by structural alignment using the PyMol software and the validated complexes were subjected to Molecular Dynamics simulations using the GROMACS package. The refined complexes were then analyzed using the PyMol and LigPlotPlus softwares and the GROMACS and gmx_MMPBSA packages, and the substrate binding sites and relevant amino acid residues involved in their binding and recognition were studied. The Comparative Modeling of human Sirtuin 2 and its homologues from the species L. infantum, L. major and L. braziliensis, the Molecular Dynamics simulations carried out with the constructed and validated enzymatic models complexed with their natural ligands, the interaction energy calculations between the models and their substrates and the comparative structural study carried out between them provide us with a theoretical basis for the search for new Sirtuin 2 inhibitors that are more selective and potent against the parasitic enzymes, paving the way for the development of safer and more effective leishmanicidal drug candidates

Discovery of novel KRAS‒PDEδ inhibitors with potent activity in patient-derived human pancreatic tumor xenograft models

KRAS‒PDEδ interaction is revealed as a promising target for suppressing the function of mutant KRAS. The bottleneck in clinical development of PDEδ inhibitors is the poor antitumor activity of known chemotypes. Here, we identified novel spiro-cyclic PDEδ inhibitors with potent antitumor activity both in vitro and in vivo. In particular, compound 36l (K D = 127 ± 16 nmol/L) effectively bound to PDEδ and interfered with KRAS-PDEδ interaction. It influenced the distribution of KRAS in Mia PaCa-2 cells, downregulated the phosphorylation of t-ERK and t-AKT and promoted apoptosis of the cells. The novel inhibitor 36l exhibited significant in vivo antitumor potency in pancreatic cancer patient-derived xenograft (PDX) models. It represents a promising lead compound for investigating the druggability of KRAS‒PDEδ interaction.

Aplicação de planejamento baseado na estrutura do receptor na busca de inibidores de cisteíno-proteases parasitárias (cruzaína (T. cruzi) e PCB (Leishmanioses) / Structure-based virtual screening in the search of parasitic cysteine-proteases inhibitors

Doenças causadas por agentes infecciosos e parasitários são chamadas negligenciadas por não despertarem interesse das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Essas doenças são responsáveis por levar milhões de pessoas à morte todos os anos e afetam principalmente os países pobres e em desenvolvimento. Dentre estas, a doença de Chagas e as leishmanioses, parasitoses causadas por parasitas flagelados pertencentes à família Trypanosomatidae, T. cruzi e Leishmaina sp., respectivamente, se apresentam como um sério problema de saúde pública mundial. Endêmicas em vários países e causando milhões de mortes anualmente, ainda hoje não existem fármacos eficientes e seguros para o tratamento dessas doenças. Este panorama torna eminente a necessidade de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para essas parasitoses. A busca por agentes quimioterápicos envolve a seleção de vias metabólicas essenciais à sobrevivência dos parasitas. Dentre estas, destacamse cisteíno-proteases presentes nesses tripanossomatídeos, deste modo a cruzaína no T. cruzi, e a CPB2.8 na Leishmania mexicana, se mostram como alvos bioquímicos promissores. A disponibilidade de estruturas cristalográficas da cruzaína e do sequenciamento genômico da CPB2.8, nos permite utilizar estratégias de planejamento de fármacos baseado no receptor (SBDD) na identificação de candidatos a fármacos para essas doenças. Entre as técnicas modernas de SBDD utilizadas, a triagem virtual possibilita identificar promissores candidatos a novos fármacos. Assim neste trabalho, obteve-se por meio da técnica de modelagem comparativa o modelo da enzima CPB2.8 de L. mexicana, visto a indisponibilidade da estrutura cristalográfica no Protein Data Bank (PDB). De modo a refinar o modelo construído realizou-se a simulação por dinâmica molecular de 100ns, apresentando estabilização a partir de 80ns. A simulação por dinâmica molecular foi validada por meio do gráfico de Ramachandran, gráfico de raio de giro, RMSD, gráfico de superfície hidrofóbica. Foram calculados os mapas de interação molecular no programa GRID das seguintes proteínas: cruzaína, CPB2.8, catepsina B e catepsina L, e, posteriormente, foi construído um modelo farmacofórico baseado no sítio ativo das enzimas cruzaína e CPB2.8. O modelo farmacofórico da cruzaína foi validado por curva ROC apresentando valor de AUC 61%. A triagem virtual foi realizada para ambas as proteínas e foram obtidos 369 compostos para a cuzaína e 225 compostos para a CPB2.8. Foi realizado o ancoramento molecular desses compostos obtidos pela triagem virtual a fim de diminuir a quantidade de compostos a serem avaliados experimentalmente

Neglected diseases are caused by parasites and infectious agents and affect mainly people in poor areas being prevalent in 149 countries and causing 534,000 deaths per year. Among neglected diseases we can highlight Chagas Disease and Leishmaniasis, both have a high rate of morbidity and mortality and both are addressed in this project in the search of new drugs against a NTD. Nowadays, the search for new drugs involves the selection of biological pathways essential for parasite survival, in this class of parasites we can suggest the cysteine proteases, a proteases family present in Trypanosoma cruzi and and Leishmania ssp. In order to obtain a new agent against Neglected Disease in this work was obtained the model of the enzyme CPB2.8 of L. mexicana using the comparative modeling technique, due to the unavailability of the crystallographic structure in the Protein Data Bank (PDB). In order to refine the constructed model was performed the molecular dynamics simulation of 100ns, stabilization was achieved from 80ns. Molecular dynamics simulation was validated using the Ramachandran graph, radius of rotation graph, RMSD, hydrophobic surface area graph. The molecular interaction fields were calculated in the GRID program to cruzain, CPB2.8, cathepsin B and cathepsin L. Based on molecular interaction fields generated pharmacophoric models were constructed using information about the active site of the enzymes cruzain and CPB2.8. The pharmacophoric model of cruzain was validated by ROC curve presenting AUC value of 61%. Virtual screening was performed for both proteins and 369 compounds were obtained for cuzain and 225 compounds for CPB2.8. Docking studies of these compounds was performed in order to decrease the amount of compounds to be evaluated experimentally

Busca por inibidores seletivos de Sirtuína 2 de T. cruzi empregando técnicas de planejamento de fármacos baseadona estrutura do receptor / Search for selective inhibitors of T. cruzi Sirtuin 2 employing drug design techniques based on receptor structure

A doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, acomete entre 6 a 8 milhões de pessoas em todo o mundo. Conhecida como tripanossomíase americana, por ter sido considerada endêmica apenas na América Latina, esta doença, se espalhou para outros continentes devido aos movimentos migratórios se tornando um problema de sáude mundial. Estima-se que 56.000 novos casos e cerca de 12.000 mortes por complicações relacionadas à doença de Chagas anualmente. A quimioterapia disponível para o tratamento é composta apenas por dois fármacos, nifurtimox e benznidazol, no entanto são pouco eficazes na fase crônica da doença. Estes fármacos apresentarem, ainda, efeitos adversos graves e resistência por parte de algumas cepas do parasita. Diante deste panorama, é iminente a necessidade da busca de novos fármacos contra T. cruzi. Para a busca racional de novos quimiterapicos antiparasitários é fundamental a identificação e caracterização de vias metabólicas essenciais à sobrevivência dos parasitas. Assim, a enzima sirtuína 2 - Silent Information Regulator 2 (Sir2), tem importante papel para a infecção por T. cruzi, pois está totalmente envolvida no seu ciclo celular do parasita. Esta é uma enzima NAD+ dependente da classe III histona desacetilases, e se mostra como um interessante alvo bioquímico para o desenvolvimento de antichagásicos. A disponibilidade do sequenciamento genômico da Sir2 nos permite utilizar estratégias de planejamento de fármaco baseado no receptor (SBDD - Structure Based Drug Design) na identificação de candidatos a fármacos para essa doença. Entre as técnicas modernas de SBDD utilizadas, a triagem virtual possibilita identificar e selecionar inibidores enzimáticos potentes e seletivos para o alvo escolhido. Assim, neste trabalho, foi construído por meio da técnica de modelagem comparativa o modelo da enzima Sir2 de T. cruzi. Uma simulação por dinâmica molecular de 200ns, foi realizada para averiguar a estabilidade do modelo obtido. Diante da estabilização do modelo a partir de 100ns, o mesmo foi validado utilizando análise de clusters, RMSD (Root-mean-square Deviation) e análises de frequência de ligações de hidrogênio com o Cofator (NAD+) e os aminoácidos do sítio de catálise foram observadas, estes passos de simulação e validação foram realizados no programa DESMOND. Com o modelo robusto, os campos de interações moleculares (MIFs) foram gerados no programa GRID (Molecular Discovery v2.1) com o intuito de elucidar as regiões favoráveis a interação com a enzima em relação a propriedades físico-químicas da Sir2. A partir dos MIFs favoráveis a Sir2 de T. cruzi foi possível a construção de dois modelos farmacofóricos, o qual se baseou nas interações do Cofator (NAD+) e o sítio de catálise (Nicotinamida). O mesmo foi apliacdo como filtro para Triagem Virtual no programa UNITY da plataforma SYBYL X 2.0, utilizando os bancos de dados ZINC15 e GSK. A triagem resultou na seleção de 8 compostos candidatos a inibidores. Destes foram adquiridos 6 compostos por serem considerados mais promissores devido a complementariedade molecular. Estes foram testados contra a enzima de T. cruzi Sri2. Após o ensaio foi possível avaliar a potência de 4 compostos, sendo o composto CDMS-01 (IC50 = 39,9uM) o mais promissor que será submetido à processos de otimização molecular

Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, affects between 6 and 8 million people worldwide. Also known as American trypanosomiasis, because it is considered endemic only in Latin America, but has spread to other continents due to migratory movements. It is estimated that 56,000 new cases and about 12,000 deaths from complications related to Chagas disease annually. The chemotherapy available for treatment consists of only two drugs, nifurtimox and benznidazole, however these are poorly effective in the chronic phase. These drugs also have serious adverse effects and resistance from strains of the parasite. Faced with this scenario, the need to search for new drugs against T. cruzi is imminent. For the drug planning for new antiparasitic chemotherapics, the identification and characterization of metabolic pathways essential to the survival of parasites is fundamental. Therewith, the sirtuin 2 - Silent Information Regulator 2 (Sir2) enzyme has an important role for T. cruzi infection, since Sir2 in the parasite is totally involved in its cell cycle. This is an NAD+-dependent enzyme of class III histone deacetylases, and it shows an interesting biochemical target for the development of antichagasic. The availability of Sir2 genomic sequencing allows us to use SBDD (Structure Based Drug Design) strategies in identifying drug candidates for this disease. Among the modern techniques of SBDD used, virtual screening makes it possible to identify and select potent and selective enzyme inhibitors for the chosen target. The model of the T. cruzi Sir2 enzyme was constructed using the comparative modeling technique. A molecular dynamics simulation of 200ns was performed to ascertain the stability of the obtained model. Considering the stabilization of the model from 100ns, it was validated using cluster analysis, Root-mean-square Deviation (RMSD) and hydrogen bond frequency analyzes with Cofator (NAD+) and the amino acids of the catalysis site were observed, these simulation and validation steps were performed in the DESMOND program. With the robust model, the molecular interaction fields (MIFs) were generated in the GRID program (Molecular Discovery v2.1) in order to elucidate the regions favorable to the interaction with the enzyme in relation to the physicalchemical properties of Sir2. From the MIFs favorable to Sir2 of T. cruzi it was possible to construct two pharmacophoric models, which was based on the interactions of Cofator (NAD+) and the catalysis site (Nicotinamide). It was also applied as a Virtual screening filter in the UNITY program of the SYBYL X 2.0 platform, using the ZINC15 and GSK databases. Screening resulted in the selection of 8 inhibitor candidate compounds. Six compounds were obtained from the screening, because they were considered more promising, and were tested against T. cruzi Sri2 enzyme. After the assay it was possible to evaluate the potency of 4 compounds, the most promising compound being CDMS-01 (IC50 = 39.9 µM) that will be submitted to molecular optimization processes