Establecimiento e implementación de un protocolo simplificado de expansión y cultivo de Células Madre de Pulpa Dental Humana (DPSCh) / Estabelecimento e implementação de um protocolo simplificado para expansão e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh) / Establishing and implementing a simplified protocol for the expansion and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs)

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

Characterization of Decellularized Human Pericardium for Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications / Caracterização do Pericárdio Humano Descelularizado para Engenharia de Tecidos e Aplicações de Medicina Regenerativa

Abstract Background: Pericardium tissue allograft can be used for surgical repair in several procedures. One of the tissue engineering strategies is the process of decellularization. This process decreases immunogenic response, but it may modify the natural extracellular matrix composition and behavior. Objective: The aim of this study was to evaluate the effectiveness of cell removal, maintenance of extracellular matrix properties and mechanical integrity of decellularized human pericardium using a low concentration solution of sodium dodecyl sulfate. Methods: Decellularization was performed with sodium dodecyl sulfate and ethylenediaminetetraacetic acid. Histological analysis, DNA quantification, evaluation of glycosaminoglycans and collagen were performed. Biomechanical assay was performed using tensile test to compare the decellularization effects on tissue properties of tensile strength, elongation and elastic modulus. P < 0.05 was considered significant. Results: There was reduction in visible nuclei present in pericardium tissue after decellularization, but it retained collagen and elastin bundles similar to fresh pericardium. The DNA contents of the decellularized pericardium were significantly reduced to less than 511.23 ± 120.4 ng per mg of dry weight (p < 0.001). The biomechanical assay showed no significant difference for fresh or decellularized tissue. Conclusion: The decellularization process reduces cell content as well as extracellular matrix components without changing its biomechanical properties.

Resumo Fundameto: O enxerto de pericárdio pode ser usado em muitos procedimentos de correção cirúrgica. Uma das estratégias da engenharia tecidual é o processo de descelularização. No entanto, embora esse processo diminua a resposta imunogênica, a descelularização pode modificar tanto o comportamento como a composição da matriz extracelular natural. Objetivos: Avaliar a eficácia da descelularização usando baixa concentração de dodecil sulfato de sódio na remoção celular, na manutenção das propriedades da matriz extracelular e na integridade mecânica do pericárdio humano descelularizado. Métodos: A descelularização foi realizada com dodecil sulfato de sódio e ácido etilenodiamino tetra-acético. Foi realizada análise histológica, quantificação de DNA, e avaliação de glicosaminoglicanos e colágeno. O estudo biomecânico foi conduzido pelo teste de tração para comparar os efeitos da descelularização sobre as propriedades teciduais de resistência à tração, alongamento e módulo de elasticidade. Foi considerado um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo. Resultados: Observou-se uma redução na quantidade de núcleos presentes no pericárdio após a descelularização, apesar de manter quantidades similares de feixes de elastina e de colágeno. As concentrações de DNA do pericárdio descelularizado foram significativamente reduzidas para menos que 511,23 ± 120,4 ng por mg de peso seco (p < 0,001). O teste biomecânico não apontou diferenças entre os tecidos fresco e descelularizado. Conclusão: A descelularização reduziu a concentração de células bem como os componentes da matriz extracelular sem afetar suas propriedades biomecânicas.

O uso de recuperador de sangue em cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea / The use of cell saver system in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass

INTRODUÇÃO: O uso de recuperador de sangue (RS) em cirurgia cardíaca é proposto para diminuir o uso de unidades de concentrado de hemácias estocadas (UCH), que aumenta morbidade, mortalidade e reações inflamatórias. OBJETIVO: O objetivo deste estudo é avaliar se o uso do RS diminui o emprego de UCH, é custo/efetivo e traz benefícios ao paciente. MÉTODOS: Estudo prospectivo realizado entre novembro de 2009 e outubro de 2011, em 100 pacientes consecutivos, submetidos à cirurgia cardiovascular com circulação extracorpórea (CEC), hemodiluição mínima e hemofiltração. Os pacientes foram divididos em grupo 1 (sem RS) e 2 (com RS). Os critérios para a reposição de UCH foram instabilidade hemodinâmica e hemoglobina (Hb) <7-8g/dl. Foram analisados dados demográficos, Hb, hematócrito (Ht), drenagem mediastinal e reposição de UCH, em diversos intervalos, e tempos de CEC, UTI e hospital. RESULTADOS: Nos grupos 1 e 2, a idade média foi de 64,2 e 60,6 anos, com predominância do sexo masculino, o EuroSCORE logístico de 10,3 e 9,6 e a mortalidade de 2% e 4%, não relacionada ao estudo. O grupo 2 apresentou incidência de reoperações superior (12 x 6%), mas o número de UCH usado (4,31x1,25) e o tempo de internamento hospitalar (10,8x7,4) foram menores. Realizada análise uni e multivariada, que não demonstrou valores estatisticamente significativos, exceto no uso de UCH. A relação entre o custo do RS e das UCH foi custo/efetiva e o tempo de internamento, menor. CONCLUSÃO: O uso de RS diminui o número de UCH usadas, não é custo/efetivo e mostrou benefícios ao paciente.

INTRODUCTION: The use of cell saver (CS) in cardiac surgery is proposed to reduce the use of units of packed red blood cells stored (URBC), which increases morbidity, mortality and causes inflammatory reactions. OBJECTIVE: The objective is to evaluate whether the use of CS decreases the use URBC, is cost /effective and beneficial to the patient. METHODS: In a prospective study, between November 2009 and October 2011, 100 consecutive patients who underwent cardiovascular surgery with CPB, hemodilution and hemofiltration, were enrolled. Patients were divided into group 1 (no CS) and 2 (CS). The criteria for the replacement of RBC were hemodynamic instability and hemoglobin (Hb) <7-8g/dl. Demographic data, as well as Hb and hematocrit, mediastinal drainage, number of URBC and CPB, ICU and hospital time, were analysed. RESULTS: In groups 1 and 2 the average age was 64.1 and 60.6 years; predominantly male; the logistic EuroSCORE 10.3 and 9.4; mortality 2% and 4%. Group 2 had a higher incidence of reoperations (12% versus 6%), but the average of URBC used (4.31 versus 1.25) and mean length of hospital stay (10.8 versus 7.4 days) was lower. Univariate and multivariate analysis, were performed, which showed no statistically significant values, except in the use of URBC. The relationship between the CS and the cost of RBC was not cost /effective and length of stay was shorter. CONCLUSION: The use of CS decreases the number of used URBC, is not cost /effective but has shown benefits for patients.

Comparative analysis of preparation of human hepatocytes by the ethylenediamine tetraacetic acid and collagenase technique

PURPOSE: To compare the viability of human hepatocytes dissociated by the ethylenediaminetetraacetic acid and collagenase techniques. METHODS: Hepatocytes were prepared by dissociation of liver fragments obtained from hepatectomies performed for therapeutic purposes at the Service of Digestive Tract Surgery, Federal University of Triângulo Mineiro. RESULTS: During the first 4 days of the experiment, 70 percent of the cells presented birefringent membranes and were not stained with 2 percent erythrosine, and were therefore considered to be viable. During the first 3 days, hepatocyte viability was on average 71 percent in the EDTA group and 76 percent in the collagenase group, with no significant difference between groups. No significant difference was observed between groups at any time. The secretion of albumin by the cultured hepatocytes was preserved up to the seventh day. Mean albumin secretion during the first 3 days was 50 æg/ml in the two groups and a reduction of albumin production was observed from the fourth to the seventh day. Again, no significant difference was observed between groups at any time. CONCLUSION: Cell viability and preservation of albumin secretion by hepatocytes are similar for the EDTA and collagenase techniques.

OBJETIVO: Comparar a viabilidade dos hepatócitos humanos dissociados pelas técnicas do ácido etilenodiaminotetracético e da colagenase. MÉTODOS: Hepatócitos foram preparados pela dissociação de fragmentos de fígado, provenientes de hepatectomias realizadas com o objetivo terapêutico no Serviço de Cirurgia do Aparelho Digestivo da Universidade Federal do Triângulo Mineiro. RESULTADOS: Detectou-se que nos quatro primeiros dias de experimento 70 por cento das células estavam com suas membranas biorrefringentes e não se coravam pela eritrosina a 2 por cento portanto foram consideradas viáveis. Observou-se que nos três primeiros dias a viabilidade dos hepatócitos foi em média 71 por cento no grupo EDTA e 76 por cento na colagenase, diferença esta sem significado estatístico entre os grupos. Em nenhum momento, detectou-se diferença estatística entre os grupos. Com relação a preservação da secreção de albumina pelos hepatócitos em cultura observou-se que foi mantida até o sétimo dia. Da mesma forma, notou-se que nos três primeiros dias a média de secreção de albumina de ambos os grupos foi de 50 ìg/dl e que após o quarto dia verificou-se redução da produção até o sétimo dia. Também não foi observado diferença significativa em nenhum momento entre os grupos. CONCLUSÃO: A viabilidade celular e a preservação da função de secretar albumina pelos hepatócitos são semelhantes pelas técnica do EDTA e da colagenase.