Expressão e atividade de sistemas de dois componentes (TCS) de Salmonella enterica sorovar Typhimurium no contexto do metaboloma intestinal humano / Expression and activity of two-component systems of Salmonella enterica sorovar Typhimurium in the context of the human intestinal metabolome

A interação entre membros do microbioma intestinal humano, células hospedeiras e patógenos invasores pode ocorrer de diversas formas, sendo uma delas através de pequenas moléculas chamadas metabólitos. A percepção e resposta efetiva de um microrganismo às diferentes condições encontradas em seu ambiente, incluindo metabólitos produzidos por outros microrganismos, são fatores importantes para sua adaptação, sobrevivência e disseminação. Os sistemas de dois componentes (TCS) permitem a percepção e resposta a mudanças ambientais, regulando a expressão de genes específicos. Nosso grupo mostrou anteriormente que um extrato orgânico de fezes humanas (EF), bem como o ácido 3,4-dimetilbenzoico (3,4-DMB), encontrado no EF, inibe a capacidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium de invadir células hospedeiras. O presente trabalho propôs investigar o impacto do microbioma intestinal humano, bem como de pequenas moléculas produzidas por Clostridium citroniae (membro deste microbioma) na expressão e atividade dos genes de TCS de Salmonella. Os metabólitos de EF e de culturas puras de C. citroniae foram extraídos com acetato de etila e adicionados a meio de cultura. O pH do meio foi ajustado (~ 7,4) e a solução foi esterilizada por filtragem. Salmonella foi cultivada na presença ou ausência do EF e do extrato de C. citroniae, bem como do ácido 3,4-DMB, em condições aeróbias e anaeróbias, até alcançar o meio da fase logarítmica de crescimento. O RNA foi extraído para a realização de PCR em Tempo Real utilizando iniciadores direcionados a quase todos os TCS de Salmonella. Nossos resultados mostraram que vários genes de TCS envolvidos na virulência de Salmonella (SsrAB, EnvZ-OmpR, QseCB, PhoQP, TorSR, TtrRS) foram regulados diferencialmente por esses metabólitos, tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias. EnvZ-OmpR, PhoPQ e SsrAB estão diretamente envolvidos na regulação das Ilhas de Patogenicidade 1 e 2 de Salmonella. QseCB é crucial para a detecção de quorum em Salmonella, de hormônios hospedeiros e para a regulação da motilidade (swimming). Vários outros TCS também foram regulados, incluindo TorSR e TtrRS, envolvidos na regulação da respiração anaeróbica de N-óxido de trimetilamina (TMAO) e tetrationato, respectivamente. Esses compostos são importantes para a sobrevivência de Salmonella no ambiente anaeróbico do intestino humano. Nossos resultados de avaliação de expressão gênica global de Salmonella cultivada na presença de ácido 3,4-DMB (aerobiose e anaerobiose) bem como na presença do EF em anaerobiose, mostraram que genes condificados em SPI-1 e SPI-2, SPI-4 e alguns genes do TCS foram reprimidos, enquanto genes marR, marB e marA foram ativadas nessas condições. Adicionalmente, comparamos nossos resultados de RNAseq, de Salmonella cultivada na presença do ácido 3,4-DMB em aerobiose, com resultados disponíveis da base de dados Salmonella Compendium. Ainda, a capacidade de Salmonella de adentrar e sobreviver dentro de células fagocíticas (macrófagos RAW 264.7) parece ser afetada pelas três condições testadas neste trabalho. Nossos resultados mostram que importantes vias de sinalização da virulência de Salmonella podem ser moduladas pelos metabólitos presentes no microbioma intestinal humano e abrem caminhos para novas pesquisas sobre a sinalização intercelular microbioma-patógeno no ambiente intestinal.

The interaction between members of the human gut microbiome, host cells and invading pathogens often occurs through small molecules, also called metabolites. The perception and effective response of a microorganism to the different conditions found in its environment, including metabolites produced by other microbes, is important for its adaptation, survival and dissemination. Two-component systems (TCS) allow the perception and response to environmental changes by regulating the expression of specific genes. Our group previously showed that organic extracts of human feces (EF) as well as the specific metabolite 3,4-dimethylbenzoic acid (3,4-DMB) found within the EF, inhibit the ability of Salmonella enterica sorovar Typhimurium to invade host cells. In the present work, we investigated the impact of the human gut microbiome as well as small molecules produced by Clostridium citroniae (a member of this microbiome) on the expression and activity of Salmonella TCS genes. Metabolites (from feces or C. citroniae cultures) were extracted using ethyl acetate and added to culture medium. The pH of the medium was adjusted (~7.4), and the solution was filter sterilized. Salmonella was grown in the presence or absence of the organic extracts as well as 3,4-DMB acid under aerobic and anaerobic conditions until it reached mid-log growth. RNA was then extracted for Real-time PCR using primers targeting almost all Salmonella TCS. Our results showed that several TCS involved in Salmonella virulence (SsrAB, EnvZ-OmpR, QseCB, PhoQP, TorSR, TtrRS) were differentially regulated by these metabolites both in aerobic and anaerobic conditions. EnvZ-OmpR, PhoPQ, and SsrAB are directly involved in the regulation of Salmonella Pathogenicity Islands 1 and 2. QseCB is crucial for Salmonella =quorum sensing, sensing of host hormones and regulation of swimming motility. Several other TCS were also regulated, including TorSR and TtrRS, which are involved in the anaerobic respiration of trimethylamine N-oxide (TMAO) and tetrathionate, respectively. These compounds are important for Salmonella survival in the anaerobic environment of the human gut. Our results of the evaluation of global Salmonella gene expression grown in the presence of 3,4-DMB acid (aerobiosis and anaerobiosis) as well as in the presence of EF in anaerobiosis, showed that genes encoded in SPI-1 and SPI-2, SPI-4 and some TCS genes have been repressed, while multiple drug resistance genes, as well marR, marB and marA genes have been activated under these conditions. Besides, we compared our results of RNAseq, Salmonella was grown in the presence of 3,4-DMB acid in aerobiosis, with results available from the Salmonella Compendium database. Also, Salmonella's ability to enter and survive within phagocytic cells (macrophages RAW 264.7) appears to be affected by the three conditions tested in this work. Our results show that important Salmonella virulence signalling pathways can be modulated by the metabolites present in the human intestinal microbiome and open the way for further research on the microbiome-pathogen intercellular signalling in the intestinal environment.

Novos reguladores de resposta envolvidos na virulência de Pseudomonas aeruginosa / New response regulators involved in Pseudomonas aeruginosa virulence

Os sistemas de sinalização de dois componentes são sistemas prevalentes em bactérias, permitindo a adaptação a diferentes condições ambientais. O sistema de dois componentes classicamente possui uma proteína histidina quinase, o primeiro componente, capaz de reconhecer o estímulo ambiental e fosforilar o regulador de resposta, o segundo componente. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria ubíqua, capaz de infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Esse patógeno oportunista apresenta um dos maiores conjuntos de sistemas de dois componentes em bactérias, que permite que ela sobreviva numa grande gama de ambientes, incluindo humanos. P. aeruginosa UCBPP-PA14 apresenta pelo menos 64 histidina quinases e 76 reguladores de resposta codificados em seu genoma. Diversos sistemas de dois componentes já foram correlacionados com a virulência, sendo o sistema GacSA o exemplo melhor caracterizado. Há poucos estudos sistemáticos sobre o envolvimendo dos reguladores de resposta na virulência de P. aeruginosa e os sinais que induzem a ativação dos reguladores de resposta precisam ser encontrados. Para identificar novos reguladores de resposta envolvidos na patogenicidade, infecções in vitro em macrófagos e in vivo em Drosophila melanogaster foram realizadas neste trabalho. Os macrófagos foram infectados com cada mutante dos reguladores de resposta ou com a linhagem selvagem, e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-α e o clearance bacteriano foram determinados. Alternativamente, as moscas foram infectadas utilizando-se a estratégia de feeding e a sobrevivência foi verificada. Utilizando-se essas abordagens, a identificação de diversos reguladores de resposta com papel na virulência foi alcançada, além de se corfirmar o papel de reguladores de resposta já estudados. Um dos novos genes envolvidos em virulência, PA14_26570 (nomeado neste trabalho de atvR), codifica um regulador de resposta atípico com substituição no aspartato fosforilável para glutamato, o que usualmente induz um estado sempre ativo. Um mutante não polar em atvR foi construído e macrófagos infectados com a linhagem ΔatvR confirmaram um maior clearance bacteriano e maior produção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Para comprovar a participação de AtvR durante a patogênese, um modelo de pneumonia aguda em camundongos foi utilizado. Camundongos infectados com a linhagem ΔatvR apresentaram uma maior sobrevivência em comparação aos camundongos infectados com a linhagem selvagem. Além disso, os camundongos infectados com ΔatvR apresentaram menor carga bacteriana, aumento no recrutamento de neutrófilos ativados e aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ). Utilizando-se uma abordagem transcritômica (RNA-Seq), foi determindo diversos genes são regulados positivamente na linhagem superexpressando AtvR em relação à linhagem controle. Dentre esses, os clusters de respiração anaeróbia nar, nir, nor e nos estão incluídos. Esse resultado foi confirmado por qRT-PCR e análises fenotípicas, em que a linhagem ΔatvR apresentou menor crescimento e expressão da nitrato redutase durante condições de hipóxia em comparação à linhagem selvagem. Em suma, neste trabalho foi demonstrado que diversos reguladores de resposta são importantes para a virulência de P. aeruginosa em macrófagos in vitro e in vivo em Drosophila, além de caracterizar o regulador de resposta atípico AtvR, que regula a respiração anaeróbica por desnitrificação, permitindo que P. aeruginosa possa infectar e colonizar o hospedeiro com maior eficiência

Two-component systems are widespread in bacteria, allowing the adaptation to environmental changes. A two-component system is classically composed by a sensor kinase that phosphorylates a cognate response regulator. Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous proteobacterium able to cause disease in several hosts. This opportunistic pathogen presents one of the largest sets of two-component systems known in bacteria, which certainly contributes to its ability to thrive in a wide range of environmental settings, including humans. P. aeruginosa UCBPP-PA14 genome codes for at least 64 sensor kinases and 76 response regulators. Some response regulators are already known to be related to virulence, with the GacSA system as the best characterized. There are no systematic studies about the involvement of P. aeruginosa response regulators in virulence. Moreover, the input signal that triggers the response regulator activation is yet to be uncovered for most systems. To find new response regulators involved in virulence, in vitro infections werecarried out using macrophages. Briefly, the macrophages were infected with each response regulator mutant or the wild-type strain, the pro-inflammatory cytokine production (TNF-α) and the bacterial clearance were evaluated. Using this approach, we identified several response regulators involved in virulence, and we also confirmed the involvement of known response regulators in this process. One of the novel virulence-related response regulators, PA14_26570 (named here as AtvR), is an atypical response regulator with a substitution in the phosphorylable aspartate to glutamate, that usually leads to an always-on state. A non-polar mutant was constructed, and macrophage infection with ΔatvR confirmed an increased bacterial clearance as well as a higher TNF-α production as compared to the wild-type strain. To ascertain the role of AtvR during the pathogenic process, an acute pneumonia model was used. Mice infected with ΔatvR showed an increased survival as compared to mice infected with the wildtype strain. In addition, ΔatvR infected mice showed reduced bacterial burden, increased neutrophil recruitment and activation, as well as increased pro-inflammatory cytokine production (TNF-α and IFN-γ). Also, using a transcriptomic approach (RNASeq), we showed that several genes were upregulated in the strain overexpressing AtvR. These genes include the anaerobic respiration clusters nar, nir, nor and nos. This result was confirmed by qRT-PCR and phenotypic analysis, in which ΔatvR showed reduced growth and nitrate reductase expression during hypoxic conditions as compared to the wild-type strain. In conclusion, we have demonstrated that several response regulators are important for P. aeruginosa virulence in vitro. In addition, we further characterized the atypical response regulator AtvR, which regulates anaerobic respiration via denitrification, allowing this bacterium to infect and colonize the host more efficiently

Computational analysis of 1,3-propanediol operon transcriptional regulators: insights into Clostridium sp. glycerol metabolism regulation / Análisis computacional de los reguladores transcripcionales del operón 1,3-propanodiol: indicios sobre la regulación del metabolismo del glicerol en Clostridium sp / Análise computacional dos reguladores transcricionais do operon do 1,3-Propanodiol: Panorama da regulacáo do metabolismo do glicerol no Clostridium sp

We designed a strategy for the sequencing and bioinformatical characterization of the 1,3-propanediol operon regulator genes from the Colombian Clostridium sp. strain IBUN13A, which is taxonomically related to Clostridium butyricum. Three genes are proposed to be involved in the operon's transcriptional activity, the dhaS and dhaA genes through a two-component system and the third gene named dhaY, which encodes a putative transcriptional regulator similar to the domains of the dhaS/A system. Phylogenetic analyses indicated that the predicted proteins had a modular structure consisting of domains homologous to different signal transduction systems, but had significant differences concerning their conserved residues, pointing to the possibility that they constitute ancestral domains. In accordance with the prediction of functions, we propose a mechanism of regulation of the proteins studied of the 1,3-propanediol operon of the native strain, as a response to the presence of glycerol in the medium, which provides valuable information on the overall regulation of the glycerol metabolism in Clostridium sp.

Se diseñó una estrategia de amplificación, secuenciación y caracterización bioinformática de los genes reguladores del operón 1,3-propanediol (1,3-PD) de la cepa nativa colombiana Clostridium sp. IBUN 13A, relacionada taxonómicamente con Clostridium butyricum. Se identificaron tres genes que pueden estar involucrados en la regulación transcripcional de dicho operón: los genes dhaS y dhaA -a través de un sistema de transducción de señales de dos componentes-y un tercer gen que se denominó dhaY, que codifica para un regulador transcripcional putativo, similar a los dominios presentes en las proteínas del sistema DhaS/A. Los análisis filogenéticos indican que las proteínas predichas presentan una estructura modular con dominios homólogos a diferentes sistemas de transducción de señales, pero muestran diferencias importantes en los residuos conservados, lo que sugiere que podrían ser estos los dominios ancestrales. La predicción de funciones postula un mecanismo de regulación de las proteínas estudiadas sobre el promotor del operón 1,3-PD de la cepa nativa como respuesta a la presencia de glicerol en el medio, lo cual aporta información importante sobre la regulación global del metabolismo del glicerol en Clostridium sp.

Nesta pesquisa foi feita uma estratégia para a amplificacäo, sequenciamento e caracterizacäo bioinformática dos genes reguladores do operon 1,3 propanodiol (1,3-PD) da cepa colombiana Clostridium sp. IBUN 13A, relacionada taxonomicamente com o Clostridium butyricum. Tèm sido identificados tres genes que podem estar envolvidos na regulacáo transcricional do operon. Os genes dhaS e dhaA por meio de um sistema de dois componentes e o terceiro gene nomeado de dhaY, que codifica para um regulador transcridonal putativo, parecido com os dominios presentes nas proteínas do sistema DhaS/A. A análise filogenètica mostra que estas proteínas apresentam uma estrutura modular com dominios homólogos a diferentes sistemas de traducáo de sinais, mas pressupöem diferencas importantes nos residuos conservados, indicando provavelmente que possam constituir os dominios ancestrais. De acordo com a predicáo de funcöes, é postulado um mecanismo de regulacáo do sistema DhaS/A, DhaY sobre o promotor do operon 1,3-DP da cepa nativa, como resposta à presenca de glicerol no meio, aportando informacöes importantes da regulacáo global do metabolismo do glicerol no Clostridium sp.

Aggregatibacter actinomycetemcomitansarcB influences hydrophobic properties, biofilm formation and adhesion to hydroxyapatite / arcB em Aggregatibacter actinomycetmcomitans influencia propriedades hidrofóbicas, formação de biofilme e aderência a hidroxiapatita

The regulation of gene expression in the oral pathogen Aggregatibacter actinomycetemcomitans is still not fully elucidated. ArcAB is a two-component system which allows facultative anaerobic bacteria to sense various respiratory growth conditions and adapt their gene expression accordingly. This study investigated in A. actinomycetemcomitans the role of arcB on the regulation of biofilm formation, adhesion to saliva coated hydroxyapatite (SHA) and the hydrophobic properties of the cell. These phenotypic traits were determined for an A. actinomycetemcomitansarcB deficient type and a wild type strain. Differences in hydrophobic properties were shown at early and late exponential growth phases under microaerobic incubation and at late exponential phase under anaerobiosis. The arcB mutant formed less biofilm than the wild type strain when grown under anaerobic incubation, but displayed higher biofilm formation activity under microaerobic conditions. The adherence to SHA was significantly lower in the mutant when compared with the wild type strain. These results suggest that the transmembrane sensor kinase arcB, in A. actinomycetemcomitans, senses redox growth conditions and regulates the expression of surface components of the bacterial cell related to biofilm formation and adhesion to saliva coated surfaces.

A regulação da expressão gênica do patógeno oral Aggregatibacter actinomycetemcomitans não está completamente descrita. O sistema de dois componentes ArcAB permite que bactérias anaeróbias facultativas percebam diferenças nas condições respiratórias durante sua multiplicação e adaptem a expressão de genes à estas condições. Este estudo investigou em A. actinomycetemcomitans o papel de arcB na regulação da formação de biofilme, aderência à hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) e nas propriedades hidrofóbicas celulares. Estas características fenotípicas foram determinadas para uma linhagem de A. actinomycetemcomitans deficiente em arcB e para uma linhagem selvagem. Foram observadas diferenças nas propriedades hidrofóbicas entre as linhagens quando estas foram cultivadas em ambiente microaerófilo até início e final de fase exponencial e quando foram cultivadas em ambiente anaeróbio até final de fase exponencial. A linhagem arcB mutante formou menos biofilme do que a linhagem selvagem quando estas foram cultivadas sob incubação anaeróbica, porém, apresentou maior formação de biofilme quando a incubação foi realizada em condições de microaerofilia. A aderência à SHA apresentada pela linhagem mutante foi significantemente menor do que a observada pela linhagem selvagem. Estes estudos sugerem que a quinase sensora arcB, em A. actinomycetemcomitans, percebe as condições redox de multiplicação e regula a expressão de componentes de superfície bacterianos relacionados à formação de biofilme e adesão a superfícies recobertas com saliva.