Produção e caracterização de protease fibrinolítica de Streptomyces parvulus DPUA 1573 / Production and characterization of fibrinolytic protease from Streptomyces parvulus DPUA 1573

As proteases fibrinolíticas são capazes de degradar coágulos de fibrina formados dentro dos vasos sanguíneos, evitando a trombose intravascular. Em animais, a tromboflebite, que acomete frequentemente os equinos, ocasiona, em seus casos graves, a obstrução jugular e também um edema de laringe, derivando a obstrução das vias aéreas, o que possibilita um edema cerebral, ocorrendo o óbito do animal. Devido ao fato de o tratamento ser de custo elevado, faz-se necessária a investigação de outras fontesde proteases fibrinolíticas com custos menores e com menos efeitos colaterais. Diante disso, este estudo tem como objetivo produzir e caracterizar proteases fibrinolíticas obtidas de Streptomyces parvulus DPUA 1573. Para produção da enzima, foi utilizado um planejamento fatorial 24 avaliando a concentração da farinha de soja (0,5, 1,0 e 1,5%) e da glicose (0, 0,5 e 1,0g/L), temperatura (28, 32 e 37ºC) e agitação (150, 200 e 250rpm) sobre a biomassa e a atividade fibrinolítica. Pode-se verificar que a protease fibrinolítica apresentou atividade máxima (835U/mL) nas condições de concentração de 1,5% de soja, 1g/L de glicose, 28°C e 150rpm com 48 horas de fermentação. A protease fibrinolítica obtida teve temperatura e pH ótimos de 55°C e pH 9,0, respectivamente. A atividade enzimática foi inibida pelo EDTA, pelo íon Fe2+ e pelo SDS, o que indicou a enzima ser uma metaloprotease. A linhagem Streptomyces parvulus DPUA 1573 foi capaz de produzir protease fibrinolítica, possuindo características bioquímicas favoráveis à aplicação na medicina veterinária e possivelmente humana.(AU)

Fibrinolytic proteases are able to degrade fibrin clot formed in the blood vessel, avoiding intravascular thrombosis. In animals, thrombophlebitis often affects horses, and in severe cases causes obstruction of the jugular and laryngeal edema leading to airway obstruction allowing cerebral edema resulting in the death of the animal. Since treatment is costly, the investigation of other sources of fibrinolytic proteases at lower cost and with fewer side effects is needed. Thus, this study aims to produce and characterize fibrinolytic proteases from Streptomyces parvulus DPUA 1573. For enzyme production, a factorial design was performed to evaluate 24 soybean flour concentration (0.5, 1.0 and 1.5%) and glucose (0, 0.5 and 1.0g/L), temperature (28, 32 and 37°C) and agitation (150, 200 and 250rpm) on biomass and fibrinolytic activity. Fibrinolytic protease showed maximum activity (835 U/mL) under these conditions: 1.5% soybean flour, 1g/L glucose, 28°C, and 150rpm 48 hours of fermentation. The optimal temperature was 55°C and optimal pH was 9.0. Fibrinolytic protease activity was inhibited by EDTA, the ion Fe2+, and by SDS, which indicated that the enzyme is a metallo-protease. The strain Streptomyces parvulus DPUA 1573 was able to produce fibrinolytic protease with biochemical characteristics favorable for application in veterinary and human medicine.(AU)

Screening, production and biochemical characterization of a new fibrinolytic enzyme produced by Streptomyces sp. (Streptomycetaceae) isolated from Amazonian lichens / Seleção, produção e caracterização bioquímica de uma nova enzima fibrinolítica produzida por Streptomyces sp. (Streptomycetaceae) isolada de liquens da Amazônia

Thrombosis is a pathophysiological disorder caused by accumulation of fibrin in the blood. Fibrinolytic proteases with potent thrombolytic activity have been produced by diverse microbial sources. Considering the microbial biodiversity of the Amazon region, this study aimed at the screening, production and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Streptomyces sp. isolated from Amazonian lichens. The strain Streptomyces DPUA1576 showed the highest fibrinolytic activity, which was 283 mm2. Three variables at two levels were used to assess their effects on the fibrinolytic production. The parameters studied were agitation (0.28 - 1.12 g), temperature (28 - 36 ºC) and pH (6.0 - 8.0); all of them had significant effects on the fibrinolytic production. The maximum fibrinolytic activity (304 mm2) was observed at 1.12 g, 28 ºC, and pH of 8.0. The crude extract of the fermentation broth was used to assess the biochemical properties of the enzyme. Protease and fibrinolytic activities were stable during 6 h, at a pH ranging from 6.8 to 8.4 and 5.8 to 9.2, respectively. Optimum temperature for protease activity ranged between 35 and 55 °C, while the highest fibrinolytic activity was observed at 45 ºC. Proteolytic activity was inhibited by Cu2+ and Co2+ ions, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and pepstatin A, which suggests that the enzyme is a serine protease. Enzymatic extract cleaved fibrinogen at the subunits Aalpha-chain, Abeta-chain, and gama-chain. The results indicated that Streptomyces sp. DPUA 1576 produces enzymes with fibrinolytic and fibrinogenolytic activity, enzymes with an important application in the pharmaceutical industry.

A trombose é uma doença patofisiológica causada pelo acúmulo de fibrina no sangue. Proteases fibrinolíticas com potente atividade trombolítica são produzidas por diversas fontes microbianas. Considerando a biodiversidade microbiana da região amazônica, o presente estudo teve como objetivo a seleção, produção e caracterização bioquímica da enzima fibrinolítica de Streptomyces sp. isolado de líquens da Amazônia. Streptomyces DPUA1576 foi a melhor produtora com atividade fibrinolítica de 283 mm2. Três variáveis em dois níveis foram utilizadas para determinar as variáveis mais relevantes na produção da enzima fibrinolítica (FA). Os parâmetros estudados foram agitação (0.28 - 1.12 g), temperatura (28 - 36 ºC) e pH (6.0 - 8.0) e todos obtiveram efeitos significativos na produção fibrinolítica. A maior atividade fibrinolítica (304 mm2) foi obtida a 1.12 g, 28 ºC e pH 8.0. O extrato bruto da fermentação foi usado para determinar as propriedades bioquímicas da enzima. Atividades proteásica e fibrinolítica foram estáveis durante 6 horas no intervalo de pH entre 6.8 - 8.4 e 5.8 - 9.2, respectivamente. Temperatura ótima para a atividade proteásica foi entre 35 - 55 °C, enquanto que para a atividade fibrinolítica foi de 45 ºC. Atividade proteásica foi inibida por íons Cu2+ e Co2+, fluoreto de fenilmetilsulfonil e pepstatina A, na qual sugere que a enzima é uma serino-protease. O extrato enzimático degradou o fibrinogênio nas subunidades Aalfa, Abeta e gama . Os resultados apresentados indicam que Streptomyces sp. DPUA 1576 produz enzimas com atividade fibrinolítica e fibrinogenolítica, enzimas com aplicações importantes na indústria farmacêutica.

Optimization of fibrinolytic protease production from Bacillus subtilis I-2 using agro-residues

The aim of this work was to study the production of fibrinolytic protease by Bacillus subtilis I-2 on agricultural residues. Molasses substantially enhanced (63%) protease production (652.32 U/mL) than control (398.64 U/mL). Soybean meal supported maximum protease production (797.28 U/mL), followed by malt extract (770.1 U/mL), cotton cake (761.04 U/mL), gelatin (742.92 U/mL) and beef extract (724.8 U/mL). Based on the Plackett-Burman designed experiments, incubation time, soybean meal, mustard cake and molasses were identified as the significant fermentation parameters. Ammonium sulfate precipitation and DEAE sephadex chromatography resulted 4.8-fold purification of protease. Zymography showed the presence of three iso-forms in the partially purified protease preparation, which was confirmed by the SDS-PAGE analysis (42, 48, 60 kDa). Protease exhibited maximum activity at 50oC and at pH 8.0. Significant stability was observed at 30-50oC and at pH 7.0-10.0. Mg2+, Zn2+, Co2+, Ca2+, Mn2+ and Cu2+,EGTA, EDTA and aprotinin severely decreased the enzyme activity.