Unveiling oral anaerobic bacteria outer membrane vesicles: A comprehensive systematic review / Descubriendo las vesículas de membrana externa de bacterias anaerobias orales: una revisión sistemática integral

Abstract Extracellular vesicles (EV) are spherical structures limited by membranes and shed by several cell types. Specifically, outer membrane vesicles (OMVs) are nanometric particles constitutively produced by Gram-negative bacteria (GNB) under different environmental conditions. OMVs are biologically active; they are loaded with selected lipids, polysaccharides, proteins, and even different types of nucleic acids. OMVs from pathogenic oral bacteria play key roles in pathogen-host interactions, constituting a possible link between oral health and systemic disease. OMVs participate in adhesion, invasion, and damage to cells, as well as in modulating the host's immune response, biofilm formation, and promotion of virulence. The objective of this systematic review was to collect, analyze and synthesize the knowledge available on literature reviews on OMVs of the most studied pathogenic oral anaerobic GNB. This information was classified into the following categories: induction of vesiculation and biogenesis, its liberation from the parental cell, content, internalization by another host cell, and the interaction with the host cell. It was found that the most studied OMVs are those of Porphyromonas gingivalis and Bacteroides spp. and, to a lesser extent, Aggregatibacter spp., and Treponema spp. This systematic review provides a synthesis of the current knowledge regarding OMVs, with emphasis on the information available for periodontopathogens.

Resumen Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras esféricas delimitadas por membranas y producidas por varios tipos de células. En particular, las vesículas de membrana externa (OMV) son partículas nanométricas producidas constitutivamente por bacterias Gram negativas (GNB) en diferentes condiciones ambientales. Las OMV son biológicamente activas; están cargadas de lípidos, polisacáridos, proteínas e incluso diferentes tipos de ácidos nucleicos. Las OMV de bacterias orales patógenas desempeñan papeles clave en las interacciones patógeno-hospedero, constituyendo un posible vínculo entre la salud oral y las enfermedades sistémicas. Las OMV participan en la adhesión, la invasión y el daño celular, así como en la modulación de la respuesta inmunitaria del hospedero, la formación de biopelículas y la promoción de la virulencia. El objetivo de esta revisión sistemática era recopilar, analizar y sintetizar los conocimientos disponibles sobre las OMV de las GNB anaerobias orales patógenas más estudiadas. Esta información se clasificó en las siguientes categorías: inducción de la vesiculación y biogénesis, su liberación de la célula parental, contenido, internalización por otra célula hospedadora e interacción con la célula hospedadora. Se observó que las OMV más estudiadas son las de Porphyromonas gingivalis y Bacteroides spp. y, en menor medida, Aggregatibacter spp. y Treponema spp. Esta revisión sistemática ofrece una síntesis de los conocimientos actuales sobre las OMV, haciendo hincapié en la información disponible para los periodontopatógenos.

Effects of Pasturella Multocida B: 2 and its immunogens (LPS and OMP) on reproductive hormones in Nili-Ravi Buffaloes / Efeitos de Pasteurella multocida B: 2 e seus imunógenos (LPS e OMP) em hormônios reprodutivos em búfalos Nili-Ravi

Abstract Livestock is a fundamental part of the agriculture industry in Pakistan and contributes more than 11.53% to GDP. Among livestock species, the buffaloes are regarded as the black gold of Pakistan. Being the highest milk producers globally, Nili-Ravi buffaloes are the most famous ones. Buffaloes are affected by many endemic diseases, and "Hemorrhagic septicemia" (HS) is one of them. This study was designed to ascertain the effects of experimental exposure ofP. multocida B:2 (oral) and its immunogens, i.e., LPS (oral and intravenous) and OMP (oral and subcutaneous) on reproductive hormonal profiles in Nili-Ravi buffaloes. Repeated serum samples were collected from the jugular vein of experimental animals for 21 days (0, 02, 04, 08, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 and 504 hours). Hormonal assays to determine the serum concentrations of Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), Follicle-stimulating hormone (FSH), Luteinizing hormone (LH), Estrogen (E2) and progesterone (P4) were performed using (MyBioSource) commercial Elisa kits. The hormonal profile of all treatment groups of the buffalo heifers exhibited significant (P<0.05) variations as compared to the control group (G-1). These results indicate suppression in Nili-Ravi buffaloes' reproductive hormonal profile on exposure to P. multocida B:2 and its immunogens. This influence warrants that exposure to H.S may be a possible reason for delayed puberty and poor reproduction performance in Nili-Ravi buffaloes.

Resumo A pecuária é uma parte fundamental da indústria agrícola no Paquistão e contribui com 11,53% do PIB nacional. Entre as espécies de gado, os búfalos são considerados o ouro negro do Paquistão. Sendo os maiores produtores de leite em todo o mundo, os búfalos Nili-Ravi são os mais famosos. Os búfalos são afetados por muitas doenças endêmicas, entre as quais a "septicemia hemorrágica" (SH). Este estudo busca verificar os efeitos da exposição experimental de P. multocida B:2 (oral) e seus imunógenos, ou seja, LPS (oral e intravenoso) e OMP (oral e subcutâneo), nos perfis hormonais reprodutivos em búfalos Nili-Ravi. Amostras de soro repetidas foram coletadas da veia jugular de animais experimentais por 21 dias (0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 e 504 horas). Os ensaios hormonais para determinar as concentrações séricas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), hormônio foliculoestimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), estrogênio (E2) e progesterona (P4) foram realizados usando kits comerciais Elisa (MyBioSource). O perfil hormonal de todos os grupos de tratamento das novilhas bubalinas apresentou variações significativas (P < 0,05) em relação ao grupo controle (G-1). Esses resultados indicam supressão no perfil hormonal reprodutivo de búfalos Nili-Ravi na exposição a P. multocida B:2 e seus imunógenos. Essa influência garante que a exposição à SH possa ser uma possível razão para o atraso da puberdade e o baixo desempenho reprodutivo em búfalos Nili-Ravi.

Gene de virulência oipA de Helicobacter pylori como marcador molecular de gastropatias severas / Helicobacter pylori oipa virulence gene as a molecular marker of severe gastropathies

ABSTRACT Background: Helicobacter pylori is an etiologic agent of gastroduodenal diseases. The microorganism, considered a type I carcinogen, affects about 50% of the global population. H. pylori virulence factors are determinant for the clinical outcome of the infection. The outer inflammatory protein A (oipA) gene encodes an outer membrane adhesin and is related to severe gastropathies, such as gastric cancer. Objective: The aim of this study was to evaluate the association of the oipA gene with the severity of gastroduodenal diseases in dyspeptic patients in region Central Brazil. Methods: The polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the presence of H. pylori. Samples positives were used for molecular screening of the oipA gene. Gastropathies were categorized as non-severe and severe diseases. Results: Approximately 68% of patients had H. pylori and 36% were infected with H. pylori oipA+ strains. Infection was significantly associated in patients aged over 44 years (P=0.004). However, there was no association between oipA and patients' age (P=0.89). Approximately 46% of patients infected with oipA+ strains had some severe illness. Gastric adenocarcinoma was the most frequent severe gastropathy. The H. pylori oipA genotype was inversely associated with the severity of gastroduodenal diseases (OR=0.247, 95%CI: 0.0804-0.7149 and P=0.007). Conclusion: The characterization of possible molecular markers will contribute to personalized medicine, impacting the prognosis of patients.

RESUMO Contexto: Helicobacter pylori é um agente etiológico de doenças gastroduodenais. O microrganismo, considerado cancerígeno tipo I, afeta cerca de 50% da população mundial. Os fatores de virulência do H. pylori são determinantes para o desfecho clínico da infecção. O gene da proteína inflamatória externa A (oipA) codifica uma adesina da membrana externa e está relacionado a gastropatias severas, como o câncer gástrico. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a associação do gene oipA com a gravidade das doenças gastroduodenais em pacientes dispépticos na região Brasil Central. Métodos: A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para determinar a presença de H. pylori. Amostras positivas foram utilizadas para triagem molecular do gene oipA. As gastropatias foram categorizadas como doenças não severas e severas. Resultados: Aproximadamente 68% dos pacientes apresentaram H. pylori e 36% estavam infectados com cepas H. pylori oipA+. A infecção foi significativamente associada em pacientes com idade superior a 44 anos (P=0,004). No entanto, não houve associação entre oipA e a idade dos pacientes (P=0,89). Aproximadamente 46% dos pacientes infectados com cepas oipA+ tiveram alguma doença severa. O adenocarcinoma gástrico foi a gastropatia severa mais frequente. O genótipo oipA de H. pylori foi inversamente associado à gravidade das doenças gastroduodenais (OR=0,247, IC95%: 0,0804-0,7149 P=0,007). Conclusão: A caracterização de possíveis marcadores moleculares contribuirá para a medicina personalizada, impactando no prognóstico dos pacientes.

Effects of Pasturella Multocida B:2 and its immunogens (LPS and OMP) on reproductive hormones in Nili-Ravi Buffaloes

Abstract Livestock is a fundamental part of the agriculture industry in Pakistan and contributes more than 11.53% to GDP. Among livestock species, the buffaloes are regarded as the black gold of Pakistan. Being the highest milk producers globally, Nili-Ravi buffaloes are the most famous ones. Buffaloes are affected by many endemic diseases, and "Hemorrhagic septicemia" (HS) is one of them. This study was designed to ascertain the effects of experimental exposure ofP. multocida B:2 (oral) and its immunogens, i.e., LPS (oral and intravenous) and OMP (oral and subcutaneous) on reproductive hormonal profiles in Nili-Ravi buffaloes. Repeated serum samples were collected from the jugular vein of experimental animals for 21 days (0, 02, 04, 08, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 and 504 hours). Hormonal assays to determine the serum concentrations of Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), Follicle-stimulating hormone (FSH), Luteinizing hormone (LH), Estrogen (E2) and progesterone (P4) were performed using (MyBioSource) commercial Elisa kits. The hormonal profile of all treatment groups of the buffalo heifers exhibited significant (P 0.05) variations as compared to the control group (G-1). These results indicate suppression in Nili-Ravi buffaloes' reproductive hormonal profile on exposure to P. multocida B:2 and its immunogens. This influence warrants that exposure to H.S may be a possible reason for delayed puberty and poor reproduction performance in Nili-Ravi buffaloes.

Resumo A pecuária é uma parte fundamental da indústria agrícola no Paquistão e contribui com 11,53% do PIB nacional. Entre as espécies de gado, os búfalos são considerados o ouro negro do Paquistão. Sendo os maiores produtores de leite em todo o mundo, os búfalos Nili-Ravi são os mais famosos. Os búfalos são afetados por muitas doenças endêmicas, entre as quais a septicemia hemorrágica (SH). Este estudo busca verificar os efeitos da exposição experimental de P. multocida B:2 (oral) e seus imunógenos, ou seja, LPS (oral e intravenoso) e OMP (oral e subcutâneo), nos perfis hormonais reprodutivos em búfalos Nili-Ravi. Amostras de soro repetidas foram coletadas da veia jugular de animais experimentais por 21 dias (0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 e 504 horas). Os ensaios hormonais para determinar as concentrações séricas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), hormônio foliculoestimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), estrogênio (E2) e progesterona (P4) foram realizados usando kits comerciais Elisa (MyBioSource). O perfil hormonal de todos os grupos de tratamento das novilhas bubalinas apresentou variações significativas (P 0,05) em relação ao grupo controle (G-1). Esses resultados indicam supressão no perfil hormonal reprodutivo de búfalos Nili-Ravi na exposição a P. multocida B:2 e seus imunógenos. Essa influência garante que a exposição à SH possa ser uma possível razão para o atraso da puberdade e o baixo desempenho reprodutivo em búfalos Nili-Ravi.

Reactividad de sueros de ratones inmunizados con vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella entérica / Reactivity of sera from mice immunized with outer membrane vesicles derived from Salmonella enterica

La fiebre tifoidea causada por Salmonella Paratyphi A (fiebre paratifoidea) es indistinguible de la producida por Salmonella Typhi y el grado de incidencia ha aumentado en los últimos años, especialmente en el sudeste asiático. Por otro lado, la diarrea y otras complicaciones entéricas causadas por Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium continúan siendo un problema de salud grave, especialmente en países subdesarrollados. Las vacunas continúan siendo la forma más efectiva de prevenir estas enfermedades. Existen vacunas basadas en el polisacárido capsular de Salmonella Typhi que protegen contra la fiebre tifoidea; sin embargo, no hay vacunas efectivas licenciadas para uso en humanos que prevengan las enfermedades producidas por los serotipos de Salmonella no tifoideas. El desarrollo de una formulación con capacidad para proteger contra estas enfermedades sigue siendo un desafío para la comunidad científica. En este trabajo se evaluó, mediante Western blot, la reactividad de los sueros de ratones inmunizados por vía subcutánea con formulaciones basadas en vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, contra los respectivos lisados celulares, para identificar la formulación que induce la mejor respuesta inmunológica cruzada. Los resultados obtenidos indicaron una alta reactividad de todos los sueros a los lisados, sin una diferencia aparente entre ellos. Sin lugar a dudas, se deberán realizar pruebas de inmunogenicidad seguidas de pruebas de retos cruzados para identificar un candidato vacunal. Estos resultados sugieren que las vesículas de membrana externa empleadas en este estudio están compuestas por antígenos posiblemente conservados en los tres serotipos de Salmonella y que pueden inducir una respuesta inmune de amplio espectro y protección cruzada(AU)

Typhoid fever caused by Salmonella Paratyphi A (paratyphoid fever) is indistinguishable from that caused by Salmonella Typhi and the degree of incidence has increased in recent years, especially in Southeast Asia. On the other hand, diarrhea and other enteric complications caused by Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium continue to be a serious health problem, especially in underdeveloped countries. Vaccines continue to be the most effective way to prevent these diseases. There are vaccines based on Salmonella Typhi capsular polysaccharide, which protects against typhoid fever; however, there are no effective vaccines licensed for use in humans to prevent disease caused by nontyphoidal Salmonella serotypes. Developing a formulation capable of protecting against these diseases remains a challenge for the scientific community. In this work, the reactivity of the sera of mice immunized subcutaneously with formulations based on Outer Membrane Vesicles (OMV) derived from Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium, was evaluated by Western blot, against the respective cell lysates to identify the formulation that induces the best cross immune response. The results obtained indicated a high reactivity of all the sera to the lysates; without an apparent difference between them. Undoubtedly, immunogenicity tests followed by cross-challenge tests should be performed to identify a vaccine candidate. These results suggest that the OMV used in this study are composed of possibly conserved antigens in the three Salmonella serotypes and that they can induce a broad-spectrum immune response and cross protection(AU)

Una vacuna de vesículas de membrana externa de Vibrio cholerae es aún una promesa: Caracterización proteómica / Outer membrane vesicle vaccine from Vibrio cholerae is still a promise: Proteomic characterization

Las epidemias de cólera afectan a un gran número de países africanos, asiáticos y del Caribe. Los cambios climatológicos y las constantes migraciones hacen que esta enfermedad se extienda, por lo que resulta necesario disponer de vacunas protectoras. En el presente trabajo se caracterizó una nueva vacuna de vesículas de membrana externa (VMEs) obtenidas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa cepa C7258, en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba), a través de métodos proteómicos. Se identificaron 53 proteínas presentes en las VME (4 proteínas por banda electroforética) separadas por electroforesis unidimensional (1D) y digeridas con tripsina. Los fragmentos obtenidos fueron separados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masa, secuenciados e identificados mediante bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL. El patrón proteico obtenido presentó algunas de las proteínas (12 proteínas citoplasmáticas y 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro del proteoma de buena calidad para candidatos vacunales. Se estudiaron las mejores condiciones para la separación de las proteínas a través de electroforesis bidimensional. Las VME evaluadas cuentan con una composición fundamentada en proteínas necesarias para garantizar una respuesta inmune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa.

Cholera epidemics affect a large number of African, Asian and Caribbean countries. The climate changes and the constant migrations cause this disease to spread, making it is necessary to obtain protective vaccines. In the present work, a new vaccine of outer membrane vesicles (OMV) from V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype strain C7258 at Finlay Institute of vaccines (Cuba) was characterized by proteomic methods. A total of 53 proteins present in the OMV (approximate ratio of 4 proteins by electrophoresis band) were identified, separated by one dimension electrophoresis and digested by tripsin method. The fragments were separated by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry, sequenced and identified, using Swiss-Prot and TrEMBL protein databases. The pattern showed some proteins (12 cytoplasmic proteins and 5 outer membrane proteins) suggested within the highest quality proteome for vaccine candidate. The best conditions for proteins separation by two dimension electrophoresis were studied. The OMV composition was based on proteins described to the immunity response and protection against V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype.

As epidemias de cólera afetam um grande número de países africanos, asiáticos e caribenhos. As mudanças climáticas e as constantes migrações fazem com que esta doença se espalhe, portanto é necessário ter vacinas protectoras. No presente trabalho, uma nova vacina de vesículas de membrana externa (VMEs) obtidas de Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor sorotipo Ogawa cepa C7258, no Instituto de Vacinas Finlay (Cuba), através de métodos proteômicos. Foram identificadas 53 proteínas presentes nas VME (4 proteínas por banda eletroforética) separadas por eletroforese unidimensional (1D) e digeridas com tripsina. Os fragmentos obtidos foram separados por cromatografia de alta resolução (HPLC) acoplada a espectrometria de massa, sequenciados e identificados usando bancos de dados de proteínas Swiss-Prot e TrEMBL. O padrão proteico obtido apresentou algumas das proteínas (12 proteínas citoplasmáticas e 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro do proteoma de boa qualidade para candidatos vacinais. As melhores condições para a separação de proteínas através de eletroforese bidimensional foram estudadas. As VME avaliados possuem uma composição baseada em proteínas necessárias para garantir uma resposta imune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor sorotipo Ogawa.

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Caracterización proteómica de vesículas de membrana externa extraídas de Shigella sonnei / Proteomic characterisation of outer membrane vesicle extracted from Shigella sonnei

Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución(AU)

Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution(AU)

Caracterização do secretoma de cepas de Xylella fastidiosa / Characterization of the secretome Xylella fastidiosa strains

As doenças causadas pelo fitopatógeno Xylella fastidiosa, uma bactéria Gram-negativa, devem-se aos seus múltiplos fatores de virulência, tais como formação de biofilme, secreção de enzimas de degradação da parede celular do xilema (CWDE), expressão de proteínas de adesão e produção de vesículas de membrana externa (OMVs). Esses fatores de virulência são controlados por uma via de sinalização mediada por DSF (fatores de sinalização difusíveis de natureza lipídica) e relacionada com percepção de quórum. Nesse trabalho, tivemos como objetivo ampliar a caracterização do secretoma de cepas selvagens e mutantes de X. fastidiosa para evidenciar proteínas e metabólitos potencialmente associados à adaptação ao hospedeiro, virulência e patogenicidade. Desenvolvemos, paralelamente, três estudos empregando como abordagens metodológicas a proteômica, a metabolômica e a transcritômica. No primeiro estudo, comparamos o secretoma (exoproteoma) da cepa Temecula1 selvagem (WT) e do mutante no gene da sintase de DSF (ΔrpfF), o qual exibe fenótipo de hipervirulência em videiras. A este estudo associamos a comparação dos transcritomas dessas cepas. Os resultados mostraram que, mesmo no cultivo in vitro, X. fastidiosa expressa e secreta fatores de virulência previamente conhecidos (lipases-esterases e proteases), além de toxinas (microcinas) que, supostamente, teriam papel de controlar bactérias competidoras pelo mesmo nicho. No segundo estudo caracterizamos a composição de OMVs secretadas no cultivo in vitro por X. fastidiosa Fb7 e 9a5c (cepas isoladas de laranjeiras) e Temecula1 (cepa isolada de videira). Demonstramos que Fb7 produz até 57% mais OMVs que 9a5c e Temecula1 e identificamos um total de 202 proteínas distintas nas OMVs produzidas pelas 3 cepas, ampliando consideravelmente o número de proteínas secretadas por meio de OMVs descrito, até então, para X. fastidiosa. Entre as proteínas enriquecidas, citamos adesinas afimbriais, porinas, lipoproteínas, hidrolases (lipases/esterases, proteases e peptidases) e uma pectina-liase putativa. Destacamos a detecção da enzima L-ascorbato oxidase nas OMVs e sugerimos que esta enzima poderia atuar na depleção do ascorbato produzido pelo hospedeiro vegetal. Além disso, demonstramos, pela primeira vez, que OMVs de X. fastidiosa transportam ácidos graxos da família DSF, sugerindo um papel adicional para OMVs nesse fitopatógeno. Finalmente, no terceiro estudo verificamos alterações relevantes no perfil de metabólitos secretados por X. fastidiosa em resposta a sua interação com metabólitos secretados por Burkholderia phytofirmans, proposta como uma cepa para o biocontrole da doença de Pierce de videiras. Confirmamos que o sobrenadante de B. phytofirmans possui um composto de natureza apolar que induz a formação de biofilme em X. fastidiosa, contudo ainda não foi possível decifrar a natureza química deste composto

The diseases caused by the phytopathogen Xylella fastidiosa, a Gram-negative bacterium, are due to multiple virulence factors, such as biofilm formation, secretion of xylem cell wall degradation enzymes (CWDE), expression of adhesion proteins and production of outer membrane vesicles (OMVs). These virulence factors are controlled by a DSF (diffusible signaling factors of a lipidic nature) mediating signaling pathway and related to quorum sensing perception. In this work, we aimed to extend the characterization of the secretoma of wild type and mutants strains of X. fastidiosa to uncover proteins and metabolites potentially associated to host adaptation, virulence and pathogenicity. We developed three studies in parallel using proteomics, metabolomics and transcriptomics as methodological approaches. In the first study, we compared the secretome (exoproteome) of the wild type strain Temecula1 (WT) and of DSF synthase mutant (ΔrpfF) which exhibits hypervirulence phenotype in grapevines. We also compared the transcriptomes of these strains. Our results showed that, even in in vitro culture, X. fastidiosa expresses and secretes previously known virulence factors (lipasesesterases and proteases), as well as toxins (microcins) that might play a role in controlling competing bacteria in the same niche. In the second study, we characterized the composition of OMVs secreted by in vitro cultures of X. fastidiosa Fb7 and 9a5c (strains isolated from orange trees) and Temecula1 (strain isolated from grapevine). We have shown that Fb7 produces up to 57% more OMVs than the 9a5c and Temecula1. Moreover we identified a total of 202 distinct proteins in the OMVs produced by these three strains, increasing considerably the number of OMVs secreted proteins so far described for X. fastidiosa. Among the proteins enriched in OMVs, we point out afimbrial adhesins, porins, lipoproteins, hydrolases (lipases/esterases, proteases and peptidases) and a putative pectin-lyase. We highlight the detection of the enzyme L-ascorbate oxidase in the OMVs and we suggest that this enzyme could act in the depletion of ascorbate produced by the plant host. In addition, we have demonstrated, for the first time, that X. fastidiosa OMVs transport fatty acids from the DSF family, suggesting an additional role for OMVs in this phytopathogen. Finally, in the third study we verified relevant changes in the profile of metabolites secreted by X. fastidiosa in response to the interaction with metabolites secreted by Burkholderia phytofirmans that has been sugested as a biocontrol strain for Pierce's disease in grapevines. We confirm that the B. phytofirmans supernatant has a non-polar compound that induces biofilm formation in X. fastidiosa, but it has not yet been possible to elucidate the chemical nature of this compound

Detección de Chlamydia trachomatis en muestras de exudado endocervical mediante una prueba de diagnóstico rápido y dos técnicas de reacción en cadena de la polimerasa / Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical swab using rapid test and two reaction techniques polymerase chain

Introducción: Chlamydia trachomatis es el principal agente bacteriano que produce infecciones de transmisión sexual.Objetivo: detectar la presencia de C. trachomatis utilizando una prueba de diagnóstico rápido y compararla con la reacción en cadena de la polimerasa (RCP).Métodos: se procesaron 50 muestras de exudado endocervical, de mujeres sintomáticas del municipio 10 de Octubre. A las muestras se les aplicó la prueba Chlamy-check-1, un ensayo de RCP del gen del plásmido críptico y una RCP en tiempo real (RCP-TR) de la proteína mayor de la membrana externa (MOMP) de C. trachomatis, que fue utilizada como referencia. Se calculó, sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN).Resultados: de las muestras estudiadas, 44 resultaron positivas por la prueba rápida, mientras que por la RCP del plásmido críptico solo 3 muestras (6 porciento) amplificaron. Al aplicar la RCP-TR, 4 muestras (8 porciento) se confirmaron como positivas, coincidiendo 3 por los tres métodos de diagnóstico. Al evaluar la prueba Chlamy-check-1 frente a la prueba de referencia se observó una sensibilidad de 100 porciento, mientras que la especificidad fue de 13 porciento, así como un VPP de 9,1 porciento y VPN de 100 porciento. Por el contrario, la RCP del plásmido críptico mostró una sensibilidad y especificidad de 75 y 100 porciento, respectivamente; un VPP de 100 porciento y VPN de 97,9 porciento.Conclusiones: se obtuvo diferencia entre los porcentajes de positividad detectados con la prueba rápida, y las técnicas de RCP. La baja especificidad de la prueba rápida indica la necesidad de realizar estudios de evaluación de este estuche diagnóstico.

Introduction: Chlamydia trachomatis is the leading bacterial agent that causes sexually transmitted infections.Objective: to detect the presence of C. trachomatis using a rapid test and compare it with the chain reaction (PCR).Methods: 50 endocervical exudates taken from symptomatic women were processed in Diez de October municipality. The samples were applied the Chlamy-check-1 test, a PCR assay of the cryptic plasmid gene and a real-time PCR (RT-PCR) of major outer membrane protein (MOMP) of C. trachomatis which was used as reference. Sensitivity, specificity, positive (PPV) and negative (NPV) predictive value were calculated.Results: 44 samples were positive by the rapid test, whereas only three samples (6 percent) amplified by cryptic plasmid PCR. Applying RT-PCR, 4 samples (8 percent) were confirmed as positive, 3 samples matched with three diagnostic methods. In assessing the Chlamy-check-1 versus the reference test, 100 percent of sensitivity was observed, while the specificity was 13 percent> Also PPV was 9.1percent and NPV was 100 percent. On the contrary, the cryptic plasmid PCR had 75 and 100 percent of sensitivity and specificity respectively, 100 percent PPV and 97.9 percent NPV.Conclusions: the difference was obtained between the percentages of positivity detected with both the rapid test, and CPR techniques. The low specificity of the rapid test indicates the need for further studies to evaluate this diagnostic kit.

Comparison of microscopic agglutination test and indirect elisa in the diagnosis of bovine leptospirosis / Comparação da soroaglutinação microscópica e elisa indireto para o diagnóstico da leptospirose bovina

The objective of this research was to compare the results obtained by the Microscopic Agglutination Test (MAT) and indirect ELISA using outer membrane proteins (OMP) of the serovar Hardjo as antigen (ELISA/OMP-Hardjo). Ninety-three samples of blood serum from 3 to 6-year-old cattle of both sexes with no history of vaccination for leptospirosis were used. To perform the MAT, live cultures of 14 Leptospira serovars representing 11 serogroups of L. interrogans were used as antigen. Outer membrane proteins (OMP) of the serovar Hardjo (ELISAOMP/ Hardjo) were used as the ELISA antigen. Of the 93 samples tested by MAT, 37 (40%) were positive. None of the samples testing positive in the MAT were negative in the ELISA. Sensitivity was 100% and specificity 64%. A comparison of the MAT and ELISA-OMP/Hardjo tests showed 78% agreement and the Kappa index was 0.58 (p<0.0001). The ELISA-OMP/Hardjo proved to be a sensitive test for the diagnosis of bovine leptospirosis, indicating its potential use as a screening test and for epidemiological studies. The titration results obtained by MAT and by optical density (OD) in the ELISA-OMP/Hardjo test showed a positive correlation, and as the antibody titers in the MAT increased, so did the OD in ELISA, demonstrating the correspondence between the tests evaluated here.

O objetivo desta pesquisa foi comparar os resultados obtidos pela Soroaglutinação Microscópica (SAM) e pelo ELISA indireto empregando proteínas de membrana externa (PME) do sorovar Hardjo como antígeno (ELISA/PME-Hardjo). Utilizou-se 93 amostras de soro sanguíneo de bovinos de ambos os sexos com idade entre três a seis anos e sem histórico de vacinação para leptospirose. Para a realização da SAM utilizou-se como antígeno culturas vivas de 14 sorovares de Leptospira, representando 11 sorogrupos de L. interrogans. Empregou-se como antígeno do ELISA, proteínas de membrana externa (PME) do sorovar Hardjo (ELISA-PME/Hardjo). Das 93 amostras testadas na SAM, 37 (40%) foram positivas. Já o ELISA-PME/Hardjo identificou 57 (62%) positivas e 36 (38%) negativas. Nenhuma amostra positiva na SAM foi negativa no ELISA. A sensibilidade foi de 100% e especificidade 64%. A comparação dos testes de SAM e ELISA-PME/Hardjo demonstrou concordância de 78% e índice Kappa de 0,58 (p<0,0001). O ELISAPME/ Hardjo revelou-se como um teste sensível para o diagnóstico da leptospirose bovina, indicando seu uso potencial como exame de triagem e para estudos epidemiológicos. A correlação dos resultados obtidos pela titulação na SAM e DO no ELISA-PME/Hardjo foi positiva, sendo que a medida que os títulos de anticorpos na SAM aumentaram, a DO no ELISA também aumentou, demonstrando haver correspondência entre os exames avaliados.

Análise molecular da expressão do fenótipo multi-droga resistente (MDR) em enterobactérias isoladas de amostras clínicas após exposição in vitro ao Imipenem / Molecular analysis of multi-drug resistant phenotype expression (MDR) in enterobacteria isolated from clinical specimens after exposure in vitro to imipenem

Após o surgimento e disseminação das ß-lactamases de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenemeertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha devido à estabilidade apresentada contra estas enzimas. A desvantagem destes antibióticos é a sua capacidade de induzir resistência aos ß-lactâmicos e a outros antibióticos quimicamente não relacionados. O imipenem tem favorecido a indução de cefalosporinases cromossômicas (AmpC) e também tem sido relacionado, in vivo, com a seleção de mecanismos intrínsecos de resistência, contribuindo com o perfil multi -droga resistente (MDR). Esse perfil é freqüentemente associado à diminuição da permeabilidade por alteração na síntese de porinas em conjunto com um aumento da atividade de bombas de efluxo, as quais não permitem o estabelecimento de uma concentração ativa do antibiótico no interior da célula bacteriana. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o estabelecimento do perfil MDR em enterobactérias provenientes de isolados clínicos em função da exposição a diferentes concentrações de imipenemin vitro. A seleção do grupo das amostras estudadas foi feito por meio da determinação do perfil de sensibilidade dos isolados, tipagem molecular e ensaio de hidrólise de Imipenem. Nos isolados selecionados para a indução foi realizada numa etapa inicial (etapa basal) a análise de porinas de membrana externa por SDS-PAGE e o estudo de genes codificadores de ß-lactamases pela técnica de PCR. O estudo do estabelecimento do perfil MDR foi feito por meio de passagens sucessivas das amostras em meio contendo concentrações sub-inibitórias de imipenem seguido de análise fenotípica (CIM e acúmulo do antibiótico intracelular e SDS-PAGE), e a análise da expressão gênica de genes associados a permeabilidade de membrana (ompC, ompF eAcrA) e genes reguladores(marA e ompR). Após a indução com o imipenem, 77% dos isolados induzidos aumentaram a CIM para os carbapenêmicos, mudando assim o perfil de resistência observado na etapa basal Também foi afetado o perfil de resistência para outros antibióticos não relacionados a ß-lactámicos, porém numa percentagem menor. Com relação à alteração da permeabilidade, a perda de porina foi observada apenas para um isolado, no entanto a diminuição na expressão gênica de Omp36 foi significativa desde o começo da indução. A expressão da bomba de efluxoAcrAB foi afetada pela indução com imipenem, aumentando significativamente a expressão de AcrA, enquanto os reguladores estudados, MarA e OmpR tiveram a sua expressão induzida pelo imipenem. Foi possível observar também associação do nível de expressão gênica do regulador MarA com a expressão de AcrA,porém não foi possível observar uma associação estatisticamente significativa deste regulador com o perfil de expressão de OMPs. A indução de OmpR foi associado com um aumento da expressão de RNAm de Omp35, já para Omp36 foi possível observar apenas uma tendência na repressão deste gene. O estudo da resposta destes genes reguladores e determinantes de resistência, em resposta à exposição ao com o imipenem in vitro, permitiu reportar o comportamento molecular da bactéria numa resposta adaptativa no estagio inicial do estabelecimento do fenótipo MDR. A utilização de isolados clínicos com diversos determinantes de resistência permitiu observar a variabilidade nas respostas adaptativas das enterobacterias, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de adaptação da bactéria e sua contribuição na falha terapêutica

After emergence and broad dissemination of extended spectrum ß-lactamases into the Enterobacteriaceae family, the carbapenemic antibiotics (imipenem, meropenem and ertapenem) have been considered the chosen therapy in the treatment of nosocomial infections by the stability that these antibiotics show to these enzymes. The disadvantage of carbapenems is theirs capacity to induce resistance against ß-lactamics and to other chemically unrelated antibiotics. The imipenem has been shown to induce chromosomal cephalosporinases (AmpC) and it was also related, in vivo, with the selection of intrinsic mechanism leading to multi-drug resistance profile (MDR). This profile is usually associated with membrane impermeability due to reduced outer membrane porin synthesis with an incremented activity of efflux pumps, which results in a reduced concentration of antibiotics inside the bacteria. This study aimed to evaluate the establishment of the MDR profile in Enterobacteriaceae from clinical isolates by exposure to different concentrations of imipenem in vitro. The selection of the study group was performed by determination of antibiotic susceptibility profile,molecular typing and hydrolysis assay of imipenem. In the selected isolates submitted to induction, in an initial step (baseline), was performed the outer membrane porin analysis by SDS-PAGE and the gene-specific amplification of B-lactamase enzymes by PCR. The study of the establishment of MDR was performed by progressive passages with subclinical concentrations of imipenem, followed each one by the evaluation of phenotypic profile (MIC, accumulation antibiotic in celland SDS-PAGE) and gene expression analysisof genes related to membrane permeability (ompC, ompF and acrA) and regulatory genes(MarA and ompR). After induction with imipenem, 77 % of the isolates increased the MIC for the carbapenems, changing the resistance profile at the baseline. In a lesser percentage, the resistance profile to other ß-lactams-unrelated antibiotics was also affected. Loss of porin was observed only for an isolated, however a significantly decreased Omp36 mRNA expression was observed from the start of induction. The expression of the efflux pump AcrAB ,was also affected by the imipenem induction, significantly increasing the AcrA gene expression, whereas the studied regulatory genes,MarA and OmpR,were induced by the imipenem. It was also possible to observe an association between the expression of the regulator MarA and the expression of AcrA, nevertheless no association was observed between this regulator and OMPs . OmpR induction was associated with an increased Omp35mRNA expression, however only a trend for the repression of Omp36was observed. The study of the response of these regulatory genes and genetic determinants of resistance, in response to the imipenem exposure in vitro, allowed to report the molecular behavior of the bacteria in an adaptive response in the initial stage of the establishment of a MDR phenotype. The use of clinical isolates with diverse resistance determinants allowed observing the variability in adaptive responses in enterobacteria, which is important to understand the adaptive mechanisms of bacteria to this antibiotic, the involvement in the emergence of the MDR profile and its contribution to the treatment failure

Efficacy of bacterin-, outer membrane protein- and fimbriae extract-based vaccines for the control of Salmonella Enteritidis experimental infection in chickens / Eficácia de bactéria inativada (bacterina), proteína da membrana externa e extrato de fimbrias no controle de infecção experimental por Salmonella Enteritidis (SE) em galinhas

The efficacy of three vaccines was evaluated in chickens for the control of experimental infection with Salmonella Enteritidis (SE) phage type 4. The vaccines were produced with bacterin, outer membrane proteins (OMP) and fimbriae crude extract (FE). The chickens were vaccinated intramuscularly with two doses of each vaccine at 12 and 15 weeks of age. The chickens were then orally challenged with 10(9) CFU/chicken Salmonella Enteritidis phage type 4 at 18 weeks of age. Fecal swabs were performed for the recovery of shedding SE, and SE was recovered from the liver and spleen. Additionally, antibody titers were measured in the serum by micro-agglutination test. The results indicated that the vaccine produced with bacterin yielded better results and resulted in reduction of fecal shedding and organ invasion by SE after oral challenge, although no vaccine was 100% effective for the control of SE experimental infection.

A eficácia de três vacinas de Salmonella Enteritidis fagotipo 4, produzidas na forma de bacterina, proteínas de membrana externa (OMP) e extrato bruto de fímbrias (FE) foi avaliada para proteção de aves infectadas experimentalmente. As aves foram vacinadas por via intramuscular com duas doses de cada vacina as 12 e 15 semanas de idade e desafiadas com 10(9) UFCs de Salmonella Enteritidis fagotipo 4 às 18 semanas de idade, por via oral. A eficácia foi determinada através do reisolamento da bactéria nas fezes e no fígado e baço, e os anticorpos foram mensurados no soro. Os resultados demonstraram que a vacina produzida com a bacterina foi mais eficaz em comparação às outras vacinas examinadas, para reduzir a excreção fecal e a invasão de órgãos após o desafio por SE.

Busca por alvos de regulação pelo segundo mensageiro c-diGMP em Pseudomonas aeruginosa / Search for c-di-GMP regulation targets in Pseudomonas aeruginosa

Recentemente, o bis-(3',5')-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP) surgiu como uma importante molécula sinalizadora nas bactérias. Essa molécula foi identificada como uma das responsáveis pelo controle do comportamento bacteriano e está relacionada com a patogenicidade e a adaptação de diversas bactérias, coordenando a expressão de genes envolvidos com virulência, motilidade e formação de biofilme. O mecanismo pelo qual c-diGMP atua vem sendo motivo de estudo de vários grupos de pesquisa nos últimos anos. Já foi demonstrado o papel dessa molécula em diferentes etapas do controle da expressão gênica. Acredita-se que a manipulação dos níveis de c-di-GMP pode ser uma nova abordagem terapêutica contra bactérias patogênicas. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que atua como um patógeno oportunista, causando infecções em pacientes imunocomprometidos, sendo o maior causador de infecções crônicas em pacientes portadores de fibrose cística. O genoma de P. aeruginosa PA14 apresenta vários genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo e/ou ligação de c-di-GMP, o que pode indicar um amplo papel regulatório deste nucleotídeo nessa bactéria. Uma associação infundada entre níveis elevados de c-di-GMP e a resistência aos antibióticos é geralmente assumida, já que altos níveis de c-di-GMP levam à formação de biofilme, que é comprovadamente um modo de crescimento mais resistente. Nesse trabalho, utilizando uma abordagem proteômica, mostramos que Pseudomonas aeruginosa PA14 regula a expressão de cinco porinas em resposta a variações nos níveis de c-di-GMP, independentemente dos níveis de mRNA. Uma dessas porinas, OprD, é responsável pela entrada do antibiótico ß-lactâmico imipenem na célula e é menos abundante em condições de alto c-di-GMP. Também demonstramos que linhagens com altos níveis de c-di-GMP apresentam uma vantagem competitiva de crescimento em relação a linhagens com níveis mais baixo de c-di-GMP quando crescidas em meio contendo imipenem. Em contraste, observamos que células planctônicas com elevados níveis c-di-GMP são mais sensíveis a tobramicina. Em conjunto, estes resultados mostram que c-di-GMP pode regular a resistência a antibióticos em sentidos opostos, e independentemente do crescimento em biofilme

Following the genomic era, a large number of genes coding for enzymes predicted to synthesize and degrade 3'-5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) was found in most bacterial genomes and this dinucleotide emerged as an important intracellular signal molecule controlling bacterial behavior. Diverse molecular mechanisms have been described as targets for c-di-GMP, but several questions remain to be addressed. An association between high c-di-GMP levels and antibiotic resistance is largely assumed, since high c-di-GMP upregulates biofilm formation and the biofilm mode of growth leads to enhanced antibiotic resistance; however, a clear understanding of this correlation is missing. Pseudomonas aeruginosa is a versatile gamma-proteobacterium that behaves as an opportunistic pathogen to a broad range of hosts. The ability of P. aeruginosa to form biofilms contributes to its virulence and adaptation to different environments. The P. aeruginosa PA14 genome presents several genes encoding proteins involved in metabolism or binding to c-di-GMP, which may indicate a wide regulatory role of this nucleotide in this bacterium. Here, using a proteomic approach, we show that Pseudomonas aeruginosa PA14 regulates the amount of five porins in response to c-di-GMP levels, irrespective of their mRNA levels. One of these porins is OprD, decreased in high c-di-GMP conditions, which is responsible for the uptake of the ß-lactam antibiotic imipenem. We also demonstrate that this difference leads strains with high c-di-GMP to be more resistant to imipenem even when growing as planktonic cells, giving them a competitive advantage over cells with low c-di-GMP. Contrastingly, we found that planktonic cells with high c-di-GMP levels are more sensitive to aminoglycosides antibiotics. Together, these findings show that c-di-GMP levels can regulate the antibiotic resistance to different drugs in opposite ways and irrespective of a biofilm mode of growth

Padronização e validação de elisa indireto para o diagnóstico da leptospirose bovina / Standardization and validation of elisa for diagnosis of bovine leptospirosis

A leptospirose é uma zoonose que causa sérios danos à saúde dos animais. Por se tratar de uma das doenças de maior impacto econômico, o correto diagnóstico e vigilância epidemiológica são fundamentais para o controle da infecção. Objetivou-se padronizar e validar o teste de ELISA indireto empregando proteínas de membrana externa (PME) do sorovar Hardjo como antígeno (ELISA-PME/Hardjo), tendo o teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM) como referência. O ELISA-PME/Hardjo foi padronizado utilizando-se amostras de soro de 15 bovinos positivos e 15 negativos no exame de SAM. A PME/Hardjo foi avaliada nas concentrações de 0,35 µg/µL, 0,17 µg/µL, 0,08 µg/µL e 0,04 µg/µL. As amostras de soro foram testadas nas diluições 1:50, 1:100, 1:500 e 1:1000, e o conjugado anti IgG 1:5000 e 1:10000. A validação do teste foi feita utilizando-se 218 amostras de soro bovino. A padronização do ELISA-PME/Hardjo indicou que a melhor concentração protéica para sensibilização da placa foi de 0,08 µg/µL, diluição do anticorpo primário 1:50 e do conjugado anti-IgG 1:5000. Das 218 amostras submetidas ao teste de SAM, 86 (39%) foram positivas, e 132 (61%) negativas. Já o ELISA-PME/Hardjo identificou 121 (55%) amostras positivas e 97 (45%) negativas. A sensibilidade foi de 100% e especificidade 73%. A comparação dos testes de SAM e ELISA demonstrou concordância de 0,83% e índice Kappa de 0,68 (p<0,0001). O ELISA-PME/Hardjo mostrou ser um teste sensível, indicando seu uso potencial como exame de triagem no diagnóstico da leptospirose bovina.

Leptospirosis is a zoonotic disease that causes serious health risks to animals. It is a disease of high economic impact, therefore the correct diagnosis and surveillance are essential to control infection. The aim of this study was to standardize and validate an indirect ELISA using outer membrane proteins (OMPs) of serovar Hardjo as the antigen of the test (ELISA-OMP/Hardjo), using the microscopic agglutination test (MAT) as a reference. The ELISAOMP/Hardjo was standardized using 15 serum samples from positive animals and 15 negative in the MAT. The OMP / Hardjo was evaluated at concentrations of 0.35 µg / µL, 0.17 µg / µL, 0.08 µg / µL and 0.04 µg / µL. Serum samples were tested at dilutions 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, and anti IgG conjugate in 1:5000 and 1:10000. The validation of the test was performed using 218 serum samples. The standardization of ELISA-OMP/Hardjo indicated that the best protein concentration for sensitization of the plate was 0.08 µg / µL, 1:50 dilution of primary antibody and conjugated anti-IgG 1:5000. Of the 218 samples tested in MAT, 86 (39%) were positive and 132 (61%) negative. ELISA-OMP/Hardjo already identified 121 (55%) positive samples and 97 (45%) negative. The sensitivity was 100% and specificity 73%. Comparison of MAT and ELISA tests showed concordance of 0.83% and Kappa of 0.68 (p <0.0001). The ELISA-OMP/Hardjo proved to be a sensitive test, indicating its potential as a screening tool in the diagnosis of bovine leptospirosis.

Proteína LIC10494 de Leptospira interrogans serovar Copenhageni: modelo estructural y regiones funcionales asociadas / Protein LIC10494 of Leptospira interrogans serovar Copenhageni: structural model and associated functional regions / Proteína LIC10494 de Leptospira interrogans serovar Copenhageni: modelo estrutural e regiões funcionais associadas

Objetivo. Predecir computacionalmente la estructura tridimensional de la proteína antigénica LIC10494 e inferir las regiones funcionales asociadas importantes para su antigenicidad e inmunogenicidad. Materiales y métodos. Se realizó un análisis computacional de la estructura primaria de LIC10494 a partir de los servidores BLAST, PROTPARAM, PROTSCALE, DAS, SOSUI, TOPPRED, TMAP, TMPRED, SPLIT4, PHDHTM, TMHMM2, HMMTOP2, GLOBPLOT y PROSITE. La estructura secundaria se obtuvo por consenso de los algoritmos SOPM, PREDATOR GOR4, DPM y DSC. La aproximación a la estructura terciaria se obtuvo con el algoritmo MUSTER. La minimización de energía se obtuvo a partir del campo de fuerza AMBER94 de la suite de análisis molecular SCHRODINGER, y la validación tanto estereoquímica como energética del modelo se realizó con el servidor RAMPAGE. El modelo final fue visualizado con el programa PyMol v.0,98. Resultados. En el presente estudio se propone un modelo computacional que detalla la estructura tridimensional de la lipoproteína hipotética LIC10494 y está de acuerdo con reportes experimentales previos; el estudio demuestra la existencia de patrones que podrían tener un papel importante en la patogenicidad y la protección de la bacteria frente al sistema inmune del hospedero; la presencia de una región desordenada entre los aminoácidos 80 y 140; y la presencia de un segmento transmembrana entre los aminoácidos 8 y 22. Conclusión. La coincidencia entre segmentos estructurales y funcionales sugiere que el modelo puede usarse para predecir ciertos aspectos del comportamiento biológico de la proteína en cuanto a la patogenicidad e inmunogenicidad de la bacteria.

Objective. Predict by computational means the 3D structure of the antigenic protein LIC10494 and report associated important functional regions for its pathogenicity and immunogenicity. Materials and methods. We performed a computational analysis of the primary structure of LIC10494 using the servers BLAST, PROTPARAM, PROTSCALE, DAS, SOSUI, TOPPRED, TMAP, TMpred, SPLIT4, PHDHTM, TMHMM2, HMMTOP2, GLOBPLOT and PROSITE. The secondary structure was obtained by consensus of the algorithms SOPM, PREDATOR GOR4, DPM and DSC. The approach to the tertiary structure was obtained using the algorithm MUSTER. The energy minimization was done using the AMBER94 force field of the Schrodinger suite of molecular analysis, and the stereochemistry and energy model validation was performed by the RAMPAGE server. The final model was visualized using PyMol V.0,98. Results. This study proposes a computational model that describes the 3D structure of the hypothetical lipoprotein LIC10494 and agrees with previous experimental reports; thus, our study demonstrates the existence of patterns that could play an important role in the pathogenicity and protection of the bacteria against the host immune system; the presence of a disorganized region between amino acids 80 and 140, and of a transmembrane segment between amino acids 8 and 22. Conclusion. The coincidence between structural and functional segments suggests that our model can be used to predict certain aspects of the biological behaviour of the protein according to the pathogenic and immunogenic characteristics of the bacteria.

Objetivo. Predizer computacionalmente a estrutura tridimensional da proteína antigênica LIC10494 e inferir as regiões funcionais associadas importantes para a sua antigenicidade e imunogenicidade. Materiais e métodos. Foi realizada uma análise computacional da estrutura primária da LIC10494 nos servidores, BLAST, PROTPARAM, PROTSCALE, DAS, SOSUI, TOPPRED, TMAP, TMPRED, SPLIT4, PHDHTM, TMHMM2, HMMTOP2, GLOBPLOT e PROSITE. A estrutura secundária foi obtida por consenso dos algoritmos SOPM, PREDATOR GOR4, DPM e DSC. A aproximação para a estrutura terciária foi obtida com o algoritmo MUSTER. A minimização de energia foi obtida a partir do campo de força AMBER94 do conjunto de análise molecular SCHRODINGER, e a validação estereoquímica e energética do modelo foi realizada utilizando o servidor RAMPAGE. O modelo final foi visualizado com o programa PyMol V. 0,98. Resultados. Este estudo propõe um modelo computacional que descreve a estrutura tridimensional da lipoproteína hipotética LIC10494 e concorda com anteriores relatórios experimental; o estudo demonstra a existência de padrões que poderiam desempenhar um papel importante na patogenicidade e na proteção da bactéria ao sistema imune do hospedeiro; a presença de uma região desordenada entre os aminoácidos 80 e 140, e a presença de um segmento transmembrana entre os aminoácidos 8 e 22. Conclusão. A coincidência entre os segmentos estruturais e funcionais sugere que o modelo pode ser utilizado para prever determinados aspectos do comportamento biológico da proteína na patogenicidade e imunogenicidade da bactéria.

Cinética do cultivo de Neisseria lactamica em biorreator / Bioreactor cultivation kinetics of Neisseria lactamica

Neisseria lactamica está envolvida na aquisição da imunidade natural contra Neisseria meningitidis, causadora da doença meningocócica. Vesículas de membrana externa (OMV) de N. lactamica são antígenos potenciais contra N. meningitidis. Analisou-se a cinética de biomassa, de produção de OMV, da fonte de carbono (lactato), e dos metabólitos, para maximizar a produção de OMV. Realizaram-se ensaios em biorreator, em batelada simples, batelada alimentada com lactato, com ou sem pulsos de aminoácidos e extrato de levedura (YE). Utilizou-se o meio de Catlin (MC) como meio mínimo, e analisaram-se efeitos das concentrações do lactato, aminoácidos e YE. Lactato foi consumido e citrato e acetato produzidos. Os melhores resultados obtidos foram no meio com adição de 2 g/L de YE e concentrações dobradas de lactato e 5 aminoácidos constitutivos do MC, em batelada alimentada com pulsos. O lactato apresentou efeito positivo sobre o rendimento de OMV e o YE sobre a biomassa. Os 5 aminoácidos constitutivos do MC foram necessários para obtenção de biomassa e rendimento de OMV.

Neisseria lactamica is involved with the acquisition of natural immunity to Neisseria meningitidis. N. lactamica outer membrane vesicles (OMV) are potential antigens against N. meningitidis, the pathogen of meningococcal disease. The objective of this work was to analyze the kinetics of bacterial growth, OMV production, the carbon source (lactate), and products of metabolism, to improve growing conditions and OMV production. Groups were studied in batch process, fed-batch process with lactate, fed-batch process with pulses of amino acids and YE. MC was considered as minimal medium and it was analyzed the effect of lactate, amino acids and YE. Lactate was consumed and citrate and acetate increased in the medium. The best results were in fed-batch with pulses, in MC with the double concentrations of lactate and amino acids, added with 2 g/L of YE. The lactate had a positive effect over OMV yield and YE had a positive effect over biomass. 5 amino acids of MC were necessary to obtain biomass and OMV yield.

Protein and antigen profiles of Leptospira interrogans serovar Hardjo / Perfil proteico e antigênico da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjo

The protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjo subtype hardjoprajitno associated with the bovine natural immune response was investigated. The outer membrane proteins were extracted utilizing Triton X114 and precipitated with acetone. The protein sample was then resolved by SDS-PAGE and reacted in western blot against sera from a hyperimmune rabbit and from naturally infected bovines. In silver stained gels, 14 protein bands were observed, among which four proteins, with 22, 29, 47 and 63kDa, appeared as major constituents. Western blot tests with hyperimmune rabbit antiserum detected bands corresponding to proteins with 35; 27; 24; 21; 17 and 14kDa, while 32kDa and 45kDa proteins were the most immunoreactive with sera from naturally infected bovines.

Estudou-se o perfil proteico da membrana externa da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjo, amostra hardjoprajitno, associado à resposta imune natural de bovinos infectados. Foram utilizados Triton X114 para a extração das proteínas de membrana externa e acetona para precipitá-las. As proteínas extraídas foram analisadas por SDS-PAGE e western blot contra soro de coelhos hiperimunes e de bovinos naturalmente infectados. Em géis corados com nitrato de prata, 14 bandas proteicas foram identificadas, e quatro dessas bandas, com 22, 29, 47 e 63kDa, foram as mais proeminentes. Os western blots com soro hiperimune de coelho detectaram bandas correspondentes a proteínas com pesos moleculares de 35, 27, 24, 21, 17 e 14kDa, e bandas de 32 e 45kDa destacaram-se nos testes com soros de bovinos naturalmente infectados.

Brucella: una bacteria virulenta carente de los factores de virulencia clásicos / Brucella: a devoid virulent bacterium of the classic factors of virulence

La brucelosis es una enfermedad muy antigua conocida como fiebre de Malta. Fue descrita inicialmente en forma clínica por Marston en 1859 y Sir David Bruce aisló su agente causal en 1887. La brucelosis es una zoonosis de distribución cosmopolita que ha llegado a ser un serio problema económico y de salud pública en ciertos países. Los miembros del género Brucella son patógenos intracelulares facultativos que infectan una gran variedad de mamíferos. La bacteria se trasmite por ingestión o contacto con materiales contaminados provenientes de animales enfermos. A pesar de que algunos factores de virulencia han sido relacionados con brucella, todavía no se conocen sus verdaderos factores de virulencia. Brucella no demuestra poseer factores de virulencia agresivos como exotoxinas, cápsula, plásmidos, fimbrias, flagelos o variación antigénica. Sin embargo, es muy virulenta y patogénica en sus huéspedes. Esta paradoja o controversia ha sido discutida por grupos de investigación que no aceptan la ausencia de verdaderos factores de virulencia y otros grupos que piensan que su baja actividad biológica in vitro e in vivo es per se un factor evolutivo de adaptación a la vida intracelular y como tal debe considerarse un factor de virulencia. Esta capacidad de adaptación esta probablemente relacionada con la composición de la membrana externa.

Brucellosis is an ancient disease known as Malta fever. Marston clinically described it for the first time in 1859 and its causative agent was isolated in 1887 by Sir David Bruce. Brucellosis is a zoonosis and is world wide distributed being a serious economic and public health problem in certain countries. Members of the genus Brucella are facultative intracelular pathogens, which infect and produce disease in a wide variety of mammals. Ingestion or contact with contaminated materials can infect humans. Although some factors have been implicated in the virulence of Brucella the exactly virulence mechanisms of this intracellular microorganism are not known yet. Brucella does not show aggressive virulence mechanisms such as exotoxins, anti-phagocitic capsules, plasmids, fimbria, flagella or antigenic variation. Even though it is highly pathogenic for preferred or accidental hosts. This paradigm has been discussed by groups who do not accept the absence of common virulent factors and groups that believe that the low in vitro and in vivo biological activities and silent capacity of Brucella to adapt to the intracellular environment is an evolutive virulence factor by itself. This capacity of intracellular adaptation is probably related to the outer membrane characteristic composition.