Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid Cattieya maxima Lindi / Transformación mediada por Agrobacterium de la orquídea silvestre Cattleya maxima Lindl / Transformação da orquídea silvestre Cattleya maxima Lindl mediada por Agrobacterium

Abstract Protocorms are unique anatomical structures; they are akin to rhizoids and are formed by young orchid seedlings under physiological conditions. Explanted orchid tissues produce similar structures called protocorm-like bodies (PLBs) when exposed to appropriate in vitro growing conditions. Both the propagative nature of PLBs and the easiness by which they can be generated, make these structures an attractive alternative to seed-mediated production for growing large numbers of plants. To increase somatic embryogenesis and optimize the procedure, PLBs of Cattleya maxima were transformed using the Agrobacterium tumefaciens method. The T-DNA carried a Hygromycin-resistance gene, a visible marker (GFP5-GUSA) and a rice gene encoding the Somatic Embryogenesis Receptor Kinase, deemed to be important for somatic embryogenesis. Treated PLBs generated somatic embryos developing Hygromycin-resistant plantlets. The insertion of T-DNA was confirmed by PCR, and GFP expression was observed using a fluorescent stereomicroscope. Transformed Cattleya maxima PLBs were more efficient in forming somatic embryos (60 - 80%) than untransformed controls (45 - 57%), and this contrast was maximized in hormone-free, Murashige and Skoog (MS) medium (80% of the transformed plants compared to 57% of the untransformed ones). This finding supports the notion that SERK plays an important role in Orchid embryogenesis.

Resumen Los protocormos son estructuras anatómicas únicas: son similares a los rizoides y se forman por vástagos jóvenes de orquídeas bajo condiciones fisiológicas. Los tejidos explantados de orquídeas producen estructuras llamadas Cuerpos Similares a Protocormos (PLBs) cuando están expuestos a condiciones apropiadas de crecimiento in vitro. Tanto la naturaleza propagativa de los PLBs como la facilidad con que se generan, hacen de estas estructuras una alternativa atractiva, frente a la mediada por semillas, para la producción de gran número de plantas en crecimiento. Para aumentar la embriogénesis somática y optimizar el procedimiento, se transformaron PLBs de Cattleya maxima usando el método de Agrobacterium tumefaciens. El T-DNA portaba un gen de resistencia a la Higromicina, un marcador visible (GFP5-GUSA) y un gen de arroz que codificaba para el receptor tipo quinasa de embriogénesis somática (SERK), considerado importante en la embriogénesis somática. Los PLBs tratados generaron embriones somáticos y desarrollaron plántulas resistentes a la Higromicina. La inserción del T-DNA se confirmó por PCR, y la expresión de GFP se observó usando un estereomicroscopio fluorescente. Los PLBs transformados de Cattleya maxima fueron más eficientes en desarrollar embriones somáticos (60-80%) que los controles no transformados (45-57%) y este contraste se maximizó en medio Murashige y Skoog (MS) libre de hormonas (80% de las plantas transformadas en comparación con 57% de las no transformadas). Estos hallazgos apoyan la noción de que SERK juega un papel importante en la embriogénesis de orquídeas.

Resumo Os protocormos são estruturas anatômicas únicas: são similares aos rizoides e se formam por hastes jovens de orquídeas sob condições fisiológicas. Os tecidos explantados de orquídeas produzem estruturas chamadas Corpos Similares a Protocormos (PLBs) quando estão expostos a condições apropriadas de crescimento in vitro. Tanto a natureza propagativa dos PLBs como a facilidade com que se generam, fazem com que estas estruturas sejam uma alternativa atrativa, comparativamente a mediada por sementes, para a produção de grandes números de plantas em crescimento. Para aumentar a embriogênesis somática e otimizar o procedimento, se transformaram PLBs de Cattleya maxima utilizando o método de Agrobacterium tumefaciens. O T-DNA carregava um gen de resistencia a Higromicina, um marcador visível (GFP5-GUSA) e um gen de arroz que codificava para o receptor tipo quinasa de embriogênesis somática (SERK), considerado importante na embriogênesis somática. Os PLBs tratados geraram embriões somáticos e desenvolveram plântulas resistentes a Higromicina. A inserção do T-DNA se confirmou por PCR, e a expressão de GFP se observou utilizando um estereomicroscópio de fluorescência. Os PLBs transformados de Cattleya maxima foram mais eficientes em desenvolver embriões somáticos (60-80%) que os controles não transformados (45-57%) e este contraste se potencializou em meio Murashige y Skoog (MS) livre de hormônios (80% das plantas transformadas em comparação com 57% das não-transformadas). Estes resultados apoiam a noção de que SERK desempenha um papel importante na embriogênesis de orquídeas.

Micropropagation of Brasilidium forbesii (Orchidaceae) through transverse and longitudinal thin cell layer culture / Micropropagação de Brasilidium forbesii (Orchidaceae) pela técnica 'thin cell layer' longitudinal e transversal

An efficient in vitro propagation method was established for Brasilidium forbesii (Hook.) Campacci using transverse and longitudinal thin cell layer (tTCL and lTCL, respectively) culture systems. Six-month-old protocorms from in vitro germinated seeds were used for this study. TCLs (1.0-mm thick) from protocorms were grown on Woody Plant Medium (WPM) supplemented with benzyladenine (BA) (0.5­4.0 µM).The lTCL technique was more efficient for inducing protocorm-like bodies (PLBs) and regenerating shoots than the tTCL technique. The frequency of PLB formation was influenced by BA concentration, and the lTCL explant grown on a medium containing 2.0 µM BA produced the highest percentage of new protocorms (77%) with a total of 22.7 PLBs per explant, after the first subculture on the same medium. Plantlet development was optimal on WPM medium containing 3.0 g L -1 activated charcoal, and indole-3 -butyric acid was not necessary for rooting. Regenerated plants were successfully acclimatized in a greenhouse after 16 weeks using vermiculite as the substrate (100% survival).

Foi estabelecido um método eficiente de propagação in vitro para Brasilidium forbesii (Hook.) Campacci utilizando a técnica 'thin cell layer' transversal (TCLt) e longitudinal (TCLl). Foram utilizados protocormos de seis meses obtidos da germinação in vitro. TCLs (1,0 mm de espessura) dos protocormos foram cultivados no meio 'Woody Plant Medium' (WPM), acrescido com benziladenina (BA) (0,5 a 4,0 µM). A técnica TCLl foi mais eficiente para indução de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) e regeneração de brotações do que a técnica TCLt. A frequência de formação de ESP foi influenciada pela concentração de BA e o explante TCLl, cultivado em um meio contendo 2,0 µM BA, produziu a mais alta percentagem de novos protocormos (77%), com um total de 22,7 PLBs por explante, após o primeiro subcultivo para o mesmo meio. O desenvolvimento das plântulas foi eficiente no meio WPM contendo 3,0 g L -1 de carvão ativado e o ácido indol-3- butírico (AIB) não foi necessário para o enraizamento. Plantas regeneradas foram estabelecidas com sucesso em casa de vegetação, utilizando vermiculita como substrato (100% de sobrevivência), após 16 semanas.