Biologia molecular de leveduras e sua aplicação biotecnológica para estudo de mecanismos celulares do câncer e seu tratamento / Molecular biology of yeast and its biotechnological application to study the cellular mechanisms of cancer and its treatment

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o eucarioto mais bem caracterizado quanto às vias metabólicas, celulares e funções de genes. Calcula-se que dos 6.000 genes codificadores de proteínas, pelo menos 3.000 tenham homologia com genes humanos. Além disso, mesmo quando não há homologia direta, os mecanismos moleculares são conservados e em ensaios de complementação de função é possível caracterizar funções análogas em humanos. Leveduras apresentam além de mecanismos conservados, diversas semelhanças metabólicas com células tumorais; talvez a mais marcante delas seja a repressão catabólica por glicose. Esse fenômeno causa uma superativação da via glicolítica e inibição da cadeia respiratória, o que lembra muito o efeito Warburg apresentado pelas células tumorais. Esse comportamento metabólico tem relação estreita com a homeostase redox celular. Estes fatores mostram o quanto à caracterização dessas células fúngicas pode ser aplicada ao entendimento e tratamento do câncer. Mesmo assim, 20 anos após o término do sequenciamento do genoma de S. cerevisiae, mais de 1.000 genes continuam anotados como não caracterizados. Além disso, as leveduras têm papel fundamental na produção biotecnológica de insumos farmacêuticos. Nesse texto sistematizado relato as contribuições dos meus estudos, juntamente com os resultados do meu grupo de pesquisa, usando a biologia molecular das leveduras, para responder questões aplicadas à compreensão de funções celulares (com destaque à resposta antioxidante), mecanismos moleculares de resposta aos antitumorais e produção de biofármacos. Além de modelo celular, as leveduras representam excelentes plataformas para expressão heteróloga de proteínas de interesse Biotecnológico-Farmacêutico

The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most well characterized eukaryote for metabolic, cellular and gene functions. It is estimated that of the 6,000 protein-encoding genes, at least 3,000 have homology to human genes. Moreover, even when there is no direct homology, the molecular mechanisms are conserved and through function complementation assays it is possible to characterize analogous functions in humans. Yeasts present, in addition to conserved mechanisms, diverse metabolic similarities with tumor cells; perhaps the most remarkable of them is the catabolic repression by glucose. This phenomenon causes an over activation of the glycolytic pathway and inhibition of the respiratory chain, which strongly resembles the Warburg effect presented by tumor cells. This metabolic behavior is closely related to cellular redox homeostasis. These factors show how much the characterization of these fungal cells can be applied to the understanding and treatment of cancer. Even so, 20 years after the end of the sequencing of the S. cerevisiae genome, more than 1,000 genes remain annotated as uncharacterized. In addition, yeasts play a key role in the biotechnological production of pharmaceutical inputs. In this systematized text I show the contributions of my studies, together with the results of my research group, using molecular biology of yeast to answer questions applied to understanding cellular functions (with emphasis on the antioxidant response), molecular response mechanisms to antitumor drugs and biopharmaceutical production. In addition to cellular model, yeasts represent excellent platforms for the heterologous expression of proteins of Biotechnological-Pharmaceutical interes

Um novo gene de Pseudomonas aeruginosa envolvido em percepção de quórum / A novel gene involved in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria com capacidade de colonizar diversos tipos de ambiente e infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Em humanos, comporta-se como um patógeno oportunista,estando frequentemente relacionada à infecções em indivíduos imunocomprometidos e indivíduos portadores de fibrose cística. Um mecanismo importante para a versatilidade de P. aeruginosa é o sistema de percepção de quórum (QS), onde a bactéria pode vincular expressão gênica à densidade populacional e às características do ambiente. Atualmente, sabe-se que muitos outros reguladores estão interligados com QS, entre eles, a proteína reguladora RsmA e os pequenos RNAs RsmZ e RsmY. Além disso, diversos fatores importantes para a patogenicidade da bactéria são reguladas por QS. Em P. aeruginosa PA14, um fator importante para a patogenicidade em diversos hospedeiros é a proteína KerV, cujo envolvimento com QS foi descrito pela primeira vez neste trabalho. A linhagem D12, que possui uma deleção no gene kerV, mostrou alterações em fenótipos regulados por QS, como a maior produção de piocianina, composto que contribui para virulência e persistência das infecções causada por P. aeruginosa. Por ser facilmente detectável e pela regulação de sua síntese não ter sido completamente explorada em PA14, a expressão dos genes responsáveis pela produção de piocianina é um interessante repórter na investigação do possível envolvimento de KerV com QS. Além de piocianina, D12 apresenta níveis reduzidos de ramnolipídeos. Esses fenótipos somados se assemelham aos fenótipos da mutação de rsmA, sugerindo o envolvimento de KerV com os sistemas QS e Gac-Rsm direta ou indiretamente. Neste trabalho, mostramos que KerV exerce um efeito negativo na regulação dos operons phz1 e phz2, responsáveis pela síntese de piocianina, alterando a expressão desses genes. KerV exerce também um efeito positivo na expressão da proteína RsmA, responsável pela repressão de diversos genes alvos, onde RsmA se liga ao sítio de ligação ao ribossomo no mRNA, impedindo a tradução. Ensaios de gel shift mostraram que a ligação direta de RsmA na sequência líder de phzA1 e phzA2 ocorre, elucidando a maneira pela qual KerV está envolvido na regulação da expressão dos operons phz em P. aeruginosa PA14. Mostramos também que phz2 é ativo e contribui para a síntese de piocianina, pois na ausência de phz1, os níveis do pigmento são maiores do que aqueles detectados em PA14. Isso sugere uma maior expressão de phz2 e uma regulação diferencial dos operons de acordo com as condições ambientais como possível estratégia para manter os níveis desse composto. Uma evidência dessa regulação diferencial é vista no mutante lasR. Na fase inicial de crescimento, esse mutante não produz piocianina, porém quando exposto a tempos mais longos de cultivo, a produção de piocianina é maior quando comparada a PA14. Isso é reflexo da ativação da expressão de phz1 no mutante lasR em fase estacionária tardia, enquanto phz2 permanece não expresso. Isso indica que phz2 é dependente de LasR, ainda que indiretamente. Já phz1, embora tenha sua expressão influenciada por LasR no estágio inicial de crescimento, na fase estacionária é regulado por outros fatores independentes de las

Pseudomonas aeruginosa is a gammaproteobacterium that colonizes several environments and infects phylogenetically distinct hosts. It behaves as an opportunistic pathogen in humans, often related to infection in immunocompromised individuals and cystic fibrosis patients. An important mechanism for P. aeruginosa versatility is the quorum sensing (QS) network, that allows bacteria to link gene expression to population density and environmental traits. Several additional regulators are interconnected with QS, as the regulatory mRNA binding protein RsmA and the non-coding small RNAs RsmZ and RsmY. Futhermore, key factors for pathogenicity are QS-regulated. In P. aeruginosa PA14, an important pathogenicity-related factor is the KerV protein, described for the first time here as involved in QS. D12 strain, that harbor a deletion in the kerV gene, shows alterations in QS-regulated phenotypes, such as high production of pyocyanin, a compound that contributes to virulence and persistence of P. aeruginosa infections. As the production of pyocyanin is easily detected and all mechanisms involved in its synthesis regulation are not fully described, the expression of genes responsible for production of this pigment is a good reporter to investigate KerV involvement in the QS network. Additionally, D12 also shows lower levels of rhamnolipids, another QS-regulated trait. Taken together, these phenotypes resemble the effects of a rsmA mutation, suggesting KerV involvement with QS and Gac-Rsm systems. In this work, we propose that KerV exerts a negative effect in the regulation of phz1 and phz2 operons, responsible for pyocyanin synthesis, by alterating the expression of these genes. KerV also has a positive effect on rsmA expression, responsible for the repression of several genes by blocking the ribosome binding site preventing the translation. Gel shift assays showed that RsmA binds directly in the leader sequence of phzA1 and phzA2, elucidating the manner in which KerV is involved in the regulation of phz operons expression in P. aeruginosa PA14. We also demonstrate that phz2 is actively expressed and contributes to pyocyanin production in PA14, since in the phz1 mutant the levels of pyocyanin are even higher than in the wild type strain. This suggests a phz2 higher expression and a differential regulation of phz operons according to environmental changes as a mechanism to maintain the levels of pyocyanin synthesis. An evidence for this regulation is the synthesis of pyocyanin by the lasR mutant, which does not make pyocyanin at early growth stages. However, at late stationary phase, pyocyanin production is even higher than in the wild-type strain, reflecting the LasR-independent regulation of phz1 expression, while phz2 operon remains silent

Biotecnologia translacional: hemopressina e outros peptídeos intracelulares / Translational biotechnology: hemopressin and other intracellular peptides

A biotecnologia é uma prática antiga, sendo utilizada desde o antigo Egito para a produção de pão e cerveja. No mundo contemporâneo, a biotecnologia tem sido utilizada de diversas formas, incluindo o tratamento de doenças. No universo acadêmico, a biotecnologia tem permitido um avanço rápido do conhecimento. Neste artigo, fazemos um breve resumo sobre o que é biotecnologia, sua relação com o processo de inovação e produção de biofármacos. No universo acadêmico, a biotecnologia tem contribuído de forma decisiva para a descoberta de novas moléculas bioativas, como no caso da hemopressina e de diversos outros peptídeos intracelulares.

Biotechnology has been used since ancient Egypt for the production of bread and beer. In the modern world, biotechnology has been used in several ways, including for the treatment of diseases. In academia, biotechnology has allowed a rapid advance of knowledge. In this article, we make a brief summary of what is biotechnology and its relation to the process of innovation and production of biopharmaceuticals. In academia, biotechnology has contributed decisively to the discovery of new bioactive molecules, such as in hemopressin and several other intracellular peptides.