Expressão de RNAm para TLR 2, TLR 4 e citocinas em infecção experimental por cepas de Trypanosoma cruzi de diferentes origens / mRNA expression to TLR2, TLR4 and cytokines in experimental infection with Trypanosoma cruzi strain of different origins

Receptores Toll-like (TLRs), em células apresentadoras de antígenos, têm importante papel no reconhecimento microbiano e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Na infecção por T. cruzi, a imunidade celular, medida pela atividade de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12 e IFN-γ, do perfil Th1, associadas ao TNF-α, reduz a carga parasitária na fase crônica. Simultaneamente, a IL-4 e a IL-10, do perfil Th2, são responsáveis por amortecer os fortes efeitos da ação pró-inflamatória. Características do parasita, como variação antigênica e diversidade genética das linhagens de T. cruzi, também têm influência na resposta imune do hospedeiro. Assim, este estudo teve como objetivos, em infecção experimental com cepas de diferentes origens de T. cruzi: fazer a caracterização molecular das cepas; determinar os momentos evolutivos da infecção (curva de parasitemia e sobrevida) e verificar a expressão gênica relativa de TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 e IL-4 em cada momento da infecção. Para isso, foram utilizadas duas cepas de T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos, ZMC e JLP, e a cepa Y de T. cruzi. Camundongos machos Balb/C foram infectados com 104 tripomastigotas/animal e distribuídos em: G1, infectados com a cepa Y; G2, infectados com a cepa ZMC; e G3, infectados com a cepa JLP de T. cruzi. Os momentos para a determinação da expressão gênica das variáveis estudadas foram definidos segundo curva de parasitemia e de sobrevida previamente realizadas: M1: 24 h p.i.; M2: início da fase aguda; M3: fase aguda; M4:momento da queda importante e de manutenção da parasitemia e M5: momento final, determinado pela curva de sobrevida.

Toll-like receptors (TLRs), in antigen-presenting cells, play an important role in microbial recognition and adaptive immune response development. In T. cruzi infection, cellular immunity, mediated by the activity of proinflammatory cytokines such as IL-12 and IFN-γ, of the Th1 profile, associated with TNF-α, reduces parasite load in the chronic phase. Simultaneously, IL-4 and IL-10, of the Th2 profile, are responsible for controlling the strong proinflammatory effects of Th1 profile. Parasite characteristics, such as antigen variation and genetic diversity of T. cruzi strains, also influence host immune response. Hence, by using experimental infection with T. cruzi strains of different origins, this study aimed at: performing the molecular characterization of the strains; determining the evolutive moments of the infection (parasitemia and survival curve) and analyzing the relative gene expression of TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 and IL-4 at each moment of infection. To that end, two T. cruzi strains, ZMC and JLP, isolated from chronic chagasic patients, and the Y strain of T. cruzi were used. Male Balb/C mice were infected with 104 trypomastigotes/animal and distributed into: G1, infected with the Y strain; G2, infected with the ZMC strain; and G3, infected with the JLP of T. cruzi. The moments for determination of gene expression of the studied variables were defined according to the curve of parasitemia and survival that was previously performed: M1: 24 h p.i.; M2: beginning of the acute phase; M3: acute phase; M4: moment of important decrease and maintenance of parasitemia and M5: final moment, determined by the survival curve.

Efeitos da infecção pelo Trypanosoma cruzi sobre os componentes linfóide e microambiental do timo: relação com interação timócito-epitélio tímico e morte celular / Effects of Trypanosoma cruzi on lymphoid and microenvironmental components of the thymus: relationship with thymic epithelium-thymocyte interaction and cell death

A infecção pelo Trypanosoma cruzi promove alterações em órgãos linfóides. O timo apresenta-se atrofiado com depleção de células CD4+CD8+ (DP) na fase aguda. Em órgãos linfóides periféricos, os linfonodos subcutâneos (LSC) e o baço apresentam-se hipertrofiados com aumento de células T e B, enquanto os linfonodos mesentéricos (LM) apresentam-se atrofiados devido à morte dessas células. Nesse trabalho estudamos os efeitos da infecção pelo T. cruzi sobre células epiteliais tímicas (TEC) e timócitos, bem como o papel do timo no comportamento de órgãos linfóides periféricos. Em experimentos de infecção in vitro, avaliamos TEC, abordando a expressão de ligantes e receptores da matriz extracelular (ECM), e ainda, as possíveis conseqüências desse aumento de ECM sobre a interação de TEC/timócitos ou TEC/parasita. Nossos resultados demonstram que a infecção promove diminuição do número de TEC, alterações morfológicas e aumento de ECM em culturas infectadas. Observamos também que componentes da ECM são requeridos na interação entre TEC/parasita. [...] No que se refere à interação TEC/timócitos, observamos que a adesão foi maior nas culturas infectadas, especialmente sobre TEC parasitadas. Esse aumento de adesão entre TEC/timócitos corrobora a hipótese descrita anteriormente pelo nosso grupo que a infecção favorece a migração de timócitos para periferia. Estendendo nossa análise ao compartimento linfóide do timo, investigamos a apoptose de timócitos na infecção. Observamos que a celularidade do timo diminui viii durante a infecção, juntamente com aumento de apoptose de timócitos CD4-CD8- (DN), DP, CD4 e CD8.

Procurando entender a via envolvida na apoptose desses timócitos, demonstramos que a atividade de caspases total, caspase 8, caspase 9 e caspase 3 estão aumentadas na infecção. Observamos que ambas caspases iniciadoras caspase 8 (via extrínseca, Fas, TNF, TRAIL) e caspase 9 (via intrínseca, privação de fatores) parecem estar envolvidas na depleção desses timócitos. [...] Além disso, animais infectados e tratados com zVAD apresentaram a celularidade do timo parcialmente recuperada, mais especificamente em timócitos DN e DP. Finalmente, procurando entender o papel do timo na resposta imune regional de órgãos linfóides periféricos na infecção, camundongos foram timectomizados antes da infecção para avaliação da celularidade dos LSC, LM e baço. Nossos dados demonstram que, mesmo com a ausência do timo, a hipertrofia dos LSC e a atrofia dos LM permaneciam inalterados, entretanto, encontramos significativo acúmulo de linfócitos T e B no baço de animais infectados. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as alterações observadas no componente epitelial do microambiente tímico, assim como em timócitos de animais infectados favorecem a migração e morte destes timócitos e a atrofia desse tecido. Além disso, demonstramos que células do timo possuem papel imunoregulatório no baço durante a infecção.

Trypanosoma cruzi infection promotes lymphoid organ alterations. The thymusis atrophied with CD4+CD8+(DP) thymocyte depletion in the acute phase of infection.In peripheral lymphoid organs, subcutaneous lymph nodes (LSC) and spleen presenthypertrophy, with increase of T and B cells, whereas mesenteric lymph nodes (LM)are atrophied due to the death of these cells. In this work, we studied the effects of T.cruzi infection in thymic epithelial cells (TEC) and thymocytes, as well as the role ofthymus in the behavior of peripheral lymphoid organs. In experiments of in vitro infection, we evaluated TEC, concerning the expression of extracellular matrix (ECM)ligands and receptors, and also the possible consequences of ECM increase inTEC/thymocyte or TEC/parasite interactions. Our data demonstrate that T. cruziinfection promotes a decrease of TEC number, morphological alterations and ECMincrease in infected cultures. We observed that ECM components are required in theinteraction between TEC and parasites. [...] ConcerningTEC/thymocyte interactions, we observed that adhesion was greater in infectedcultures, especially on parasitized TEC. This increase in TEC/thymocyte adhesioncorroborates the hypothesis previously described by our group that the infectionfavors migration of thymocytes to the periphery. Extending our analysis to thymiclymphoid compartment, we investigated thymocyte apoptosis following infection. We observed that thymus cellularity decreases during infection, together with theincrease of apoptosis in CD4-CD8-(DN), DP, CD4 and CD8 thymocytes.

Searching to understand what death pathway is involved in thymocyte apoptosis, wedemonstrated that the activity of total caspases, caspase-8, caspase-9 and caspase-x3 (effector caspase) are increased in infection. We observed that both initiatorcaspase-8 (extrinsic pathway, Fas, TNF, TRAIL) and caspase-9 (intrinsic pathway,factor deprivation) seem to be involved in thymocyte depletion. [...] Moreover, infected animalstreated with zVAD showed a partial recovery of thymus cellularity, more specifically inDN and DP thymocytes. Finally, searching to understand the role of the thymus in theregional immune response of peripheral lymphoid organs in infection, mice werethymectomized prior to infection to evaluation of LSC, LM and spleen cellularity. Ourdata demonstrated that, even in the absence of the thymus, LSC hypertrophy and LMatrophy were not altered; however, we found a significant accumulation of T and Blymphocytes in the spleen of infected animals. Conjointly, our results show that thealterations observed in the epithelial component of the thymus microenvironment, aswell as in thymocytes of infected animals favor the migration and death ofthymocytes and the atrophy of this tissue. Besides that, we demonstrated that thymiccells have an immunoregulatory role in the spleen during infection.

Busca de substâncias antitumorais e tripanosomicidas: estudo químico de Lentinus strigosus (Basidiomycota) e Habenaria petalodes(Orquidaceae)

As espécies estudadas neste trabalho foram selecionadas a partir de um estudo de triagem intitulado “Bioprospecção da Biodiversidade Mineira e Desenvolvimento de Novas Drogas em Minas Gerais”, em que extratos de espécies vegetais e fungos basidiomicetos, coletados em ecossistemas locais, foram submetidos a diversos ensaios biológicos. O extrato acetato em etila do meio líquido do fungo Lentinus strigosus inibiu a enzima tripanotiona redutase (TR) de Trypanosoma cruzi e seu fracionamento biomonitorado levou ao isolamento de quatro substâncias; neopanepoxidol, 6,7-epóxi-4(15)-hirsuteno-1,5-diol, hipnofilina e panepoxidona, sendo as duas últimas responsáveis pelas atividades biológicas do extrato. Esses dois metabólitos terpênicos apresentaram atividade citotóxica para três linhagens tumorais humanas (UACC-62 -melanoma; TK-10 - renal e MCF-7 - mama; CI de 3,2 μM a 11,0 μM), inibiram a proliferação de linfócitos induzidos por. fitohemaglutinina (CI de 5,9 μM e 10,0 μM), a enzima TR (CI de 48,5 μM a 1,0 μM) e o crescimento de formas amastigotas de T. cruzi (CI de 6,0 μM e 2,5 μM). Panepoxidona e hipnofilina já foram descritas anteriormente, porém, é a primeira vez que se relata o isolamento desses metabólitos em L. strigosus.

O extrato bruto etanólico de Habenaria petalodes (Orquidaceae) apresentou atividade citotóxica para três linhagens tumorais humanas a 20 μg/ mL (UACC-62 - melanoma; TK-10 -renal e MCF-7 - mama). O extrato etanólico bruto de toda a planta foi extraído com diclorometano (fração apolar) e metanol/água (fração polar) por extração líquidolíquido. A fração diclorometânica apresentou actividade citotóxica para as três linhagens de células tumorais a 20 μg/ mL e foi selecionada para posterior fracionamento biomonitorado devido a sua baixa massa e complexidade química. Devido à ausência de relatos sobre os constituintes químicos, as frações polares de Habenaria petalodes (Orquidaceae) foram priorizadas para estudo fitoquímico. A fração polar foi extraída em cartucho Sep-Pak C e forneceu as subfrações, metanólica e aquosa que foram fracionadas por técnicas cromatográficas, obtendose três derivados do ácido succínico; loroglossina, militarina e dactilorina acetilada no anel 2 e, três flavonóides: isoquercitrina, isoramnetina 3-O-β-glicopiranosídeo e 50 50 50 50. 18 isoramnetina 3,7-di-O-β-glicopiranosídeo, isolados pela primeira vez nesta espécie vegetal

Busca de substâncias antitumorais e tripanosomicidas: estudo químico de Lentinus strigosus (Basidiomycota) e Habenaria petalodes(Orquidaceae) / Search and trypanocidal antitumor substances: chemical study of Lentinus strigosus (Basidiomycota) and Habenaria petalodes (Orquidaceae)

As espécies estudadas neste trabalho foram selecionadas a partir de um estudo de triagem intitulado “Bioprospecção da Biodiversidade Mineira e Desenvolvimento de Novas Drogas em Minas Gerais”, em que extratos de espécies vegetais e fungos basidiomicetos, coletados em ecossistemas locais, foram submetidos a diversos ensaios biológicos. O extrato acetato em etila do meio líquido do fungo Lentinus strigosus inibiu a enzima tripanotiona redutase (TR) de Trypanosoma cruzi e seu fracionamento biomonitorado levou ao isolamento de quatro substâncias; neopanepoxidol, 6,7-epóxi-4(15)-hirsuteno-1,5-diol, hipnofilina e panepoxidona, sendo as duas últimas responsáveis pelas atividades biológicas do extrato. Esses dois metabólitos terpênicos apresentaram atividade citotóxica para três linhagens tumorais humanas (UACC-62 -melanoma; TK-10 - renal e MCF-7 - mama; CI de 3,2 μM a 11,0 μM), inibiram a proliferação de linfócitos induzidos por. fitohemaglutinina (CI de 5,9 μM e 10,0 μM), a enzima TR (CI de 48,5 μM a 1,0 μM) e o crescimento de formas amastigotas de T. cruzi (CI de 6,0 μM e 2,5 μM). Panepoxidona e hipnofilina já foram descritas anteriormente, porém, é a primeira vez que se relata o isolamento desses metabólitos em L. strigosus.

O extrato bruto etanólico de Habenaria petalodes (Orquidaceae) apresentou atividade citotóxica para três linhagens tumorais humanas a 20 μg/ mL (UACC-62 - melanoma; TK-10 -renal e MCF-7 - mama). O extrato etanólico bruto de toda a planta foi extraído com diclorometano (fração apolar) e metanol/água (fração polar) por extração líquidolíquido. A fração diclorometânica apresentou actividade citotóxica para as três linhagens de células tumorais a 20 μg/ mL e foi selecionada para posterior fracionamento biomonitorado devido a sua baixa massa e complexidade química. Devido à ausência de relatos sobre os constituintes químicos, as frações polares de Habenaria petalodes (Orquidaceae) foram priorizadas para estudo fitoquímico. A fração polar foi extraída em cartucho Sep-Pak C e forneceu as subfrações, metanólica e aquosa que foram fracionadas por técnicas cromatográficas, obtendose três derivados do ácido succínico; loroglossina, militarina e dactilorina acetilada no anel 2 e, três flavonóides: isoquercitrina, isoramnetina 3-O-β-glicopiranosídeo e 50 50 50 50. 18 isoramnetina 3,7-di-O-β-glicopiranosídeo, isolados pela primeira vez nesta espécie vegetal

Doença de Chagas: manual para experimentaçäo animal / Chagas diseases: manual for animal experimentation

Aborda conceitos modernos, focados nos desafios científicos e em toda a complexidade relacionada com a doença: vetores, transmissao, resposta do hospedeiro à infeccçao, normas de segurança para trabalhar com Trypanosoma cruzi, quimioterapia, doença de Chagas humana e modelos experimentais, bem como protocolos e métodos experimentais utilizados nas investigaçoes sobre a moléstia.

Estudo histológico e histométrico da glândula sublingual do rato na fase aguda da infecçäo chagásica experimental / Histological and histometric study of the rat sublingual gland in the acute phase of experimental Chagas disease

Estudou-se do ponto de vista histológico e histométrico o comprometimento da glândula sublingual do rato durante a fase aguda da infecçao chagásica. Verificou-seque diferentementeda glândula submandibulara sublingual nao mostrou nenhuma alteraçao histológica ou histométrica quanto às unidades secretoras. A ausência de inervaçao simpática é sugerida como provável causa da nao instalaçao de modificaçoes histológicas.