Seropositivity for Bovine Viral Diarrhea and Enzootic Bovine Leukemia viruses in Blanco Orejinegro cattle in Colombia and infection associated-factors / Soropositividade para o vírus da diarréia viral bovina e leucemia bovina enzoótica em bovinos Blanco Orejinegro na Colômbia e fatores associados à infecção

ABSTRACT Serological controls for diseases of viral origin in animal production systems and the identification of factors associated with infections are decisive elements to establish prevention and control measures. The aim of this study was to establish the serological status for Bovine Viral Diarrhea (BVD) and Enzootic Bovine Leukemia (EBL) viruses in Blanco Orejinegro (BON) cattle from Colombia, and to identify the factors associated with seropositivity. A cross-sectional study was conducted with a total of 498 animals of all age groups and physiological states of the BON breed were selected, belonging to 14 herds located in 6 states of Colombia, in which a survey with 27 questions was conducted. By means of the chi-square test, possible factors associated with seropositivity against the 2 viruses were identified. A sample of 4 ml of blood was taken from each animal to extract plasma and make indirect Elisa tests to detect antibodies against both pathogens. General seropositivity of 27,1% was obtained for EBL, finding as factors associated with seropositivity the inadequate disposition of placental tissues after delivery of the cows and the non-performance of serological tests on new animals entering the herd. For BVD, seropositivity obtained was 50,6%, and the factors associated with seropositivity identified were having had a history of the disease in the herd, and using semen from bulls that are not known to be free for the infection. We suggest establishing control measures considering the factors associated with each viral infection to limit their expansion in the BON cattle production systems of Colombia.

RESUMO Os controles sorológicos para doenças de origem viral nos sistemas de produção animal e a identificação de fatores associados à infecção são elementos decisivos para estabelecer medidas de prevenção e controle. O objetivo deste estudo foi estabelecer o status sorológico dos vírus da Diarréia Viral Bovina (BVD) e da Leucemia Bovina Enzoótica (EBL) em bovinos Blanco Orejinegro (BON) da Colômbia e identificar os fatores associados à soropositividade. Foram selecionados 498 animais de todas as faixas etárias e estados fisiológicos da raça BON, de 14 rebanhos localizados em seis regiões da Colômbia, nos quais foi realizada uma pesquisa para identificar possíveis fatores associados à soropositividade contra os dois vírus. Foi retirada uma amostra de 4 ml de sangue de cada animal para extrair plasma e fazer testes ELISA indiretos para detectar anticorpos contra os dois patógenos. Obteve-se soropositividade geral de 27,1% para EBL, encontrando como fatores associados à soropositividade a disposição inadequada dos tecidos placentários após o parto das vacas e a não realização de testes sorológicos em novos animais que entraram no rebanho. Para a BVD, a soropositividade obtida foi de 50,6%, e os fatores associados à soropositividade identificados foram: histórico de doença no rebanho e uso de sêmen de touros que não são reconhecidos como livres da infecção. Sugerimos o estabelecimento de medidas de controle considerando os fatores associados a cada infecção viral para limitar sua expansão nos sistemas de produção de gado BON da Colômbia.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and bovine leukemia virus seroprevalence and associated risk factors in dairy herds in Minas Gerais state, Brazil / [Soroprevalência do Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis e vírus da leucemia bovina e fatores de risco associados em rebanhos leiteiros de Minas Gerais, Brasil]

Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis (MAP) e o vírus da leucemia bovina (BLV) são agentes que causam grandes perdas econômicas nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi avaliar a situação epidemiológica da paratuberculose bovina (PTB) e leucose enzoótica bovina (EBL) em rebanhos leiteiros de Lagoa Formosa, Minas Gerais, Brasil. Foram coletadas 236 amostras de sangue de vacas, as quais foram submetidas aos testes ELISA e imunodifusão em gel de ágar para detecção de anticorpos contra MAP e BLV. A soroprevalência de anticorpos contra MAP e BVL foi de 20% para os rebanhos e 6% para os animais e de 85% para os rebanhos e 50,42% para os animais, respectivamente. A presença dessas enfermidades deve servir como um alerta para os produtores e veterinários, para que concentrem maior atenção na implementação de medidas higiênico-sanitárias, incorporando elementos de vigilância com base nos riscos identificados no estudo.(AU)

Indirect ELISA (iELISA) standardization for the diagnosis of bovine enzootic leukosis / Padronização de um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da leucose enzoótica bovina

Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease caused by bovine leukemia virus (BLV) that affects cattle worldwide. Agar gel immunodiffusion (AGID) was the reference test for EBL diagnosis for many years, but enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed higher sensitivity, was faster to perform, and resulted in an objective reading. However, the importation of ELISA kits is lengthy and expensive, and currently, no AGID kits are available in Brazil. The aim of this work was to standardize an indirect ELISA (iELISA) for EBL diagnosis using BLV antigens produced in Tadarida brasiliensis lung (Tb1Lu) cells, which are Bovine viral diarrhea virus (BVDV) free, unlike fetal lamb kidney (FLK) cells, currently used for this purpose. Following standardization, iELISA results were compared with those obtained by AGID and the commercial Chekit Leucose-Serum ELISA. Compared to AGID, iELISA had 94,44% sensitivity, 75.68% specificity, 79.10% positive predictive value (PPV) and 93.30% negative predictive value (NPV), with 84% concordance and a Kappa index of 0.699. Compared to the Chekit Leucose-Serum ELISA, iELISA showed 92.60% sensitivity, 87.09% specificity, 90.27% PPV and 90,00% NPV, with 90.27% concordance and a Kappa index of 0.801. Taking into account the high agreement with the traditional tests and the absence of non-specific reactions with BVDV, the developed assay could be used as diagnostic method to control EBL in Brazil.(AU)

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa natural dos bovinos com distribuição mundial causada pelo "bovine leukemia virus" (BLV). A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi considerada por muitos anos o teste de eleição, porém ensaios imunoenzimáticos (ELISA) apresentam sensibilidade mais elevada e leitura mais rápida e objetiva. No entanto, a importação de kits de ELISA é um processo dispendioso e demorado, e atualmente não há kits de IDGA comercialmente disponíveis no Brasil. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da LEB utilizando antígenos produzidos a partir do cultivo do BLV em linhagem celular Tadarida brasiliensis "lung" (Tb1Lu) livre de "bovine viral diarrhea virus" (BVDV), diferentemente do que acontece com as linhagens "fetal lamb kidney" (FLK) atualmente utilizadas na produção desses antígenos para uso em ensaios sorológicos. Após a padronização do iELISA, os resultados foram comparados com aqueles obtidos por IDGA e pelo ELISA comercial "Chekit Leucose-Serum". Comparado ao IDGA, o iELISA apresentou 94,44% de sensibilidade, 75,68% de especificidade, valor preditivo positivo (VPP) de 79,1% e valor preditivo negativo (VPN) de 93,3%, com concordância entre os testes de 84% e o índice Kappa 0,699. Quando comparado ao ELISA "Chekit Leucose-Serum", o iELISA apresentou sensibilidade de 92,6%, especificidade de 87,09%, VPP de 90,27% e VPN de 90%, com concordância de 90,27% e o índice Kappa 0,801. Portanto, devido à alta concordância com os testes tradicionais e ausência da ocorrência de reações inespecíficas com BVDV, o ensaio desenvolvido pode ser utilizado como ferramenta diagnóstica para o controle da LEB no Brasil.(AU)

Infección experimental en ovinos con el virus de leucosis bovina: dosis mínima de células BLV-FLK y virus libre de células, y actividad neutralizante de anticuerpos naturales / Experimental infection of sheep with Bovine leukemia virus (BLV): Minimum dose of BLV-FLK cells and cell-free BLV and neutralization activity of natural antibodies

Abstract Bovine leukemia virus (BLV) is an important cattle pathogen that causes major economic losses worldwide, especially in dairy farms. The use of animal models provides valuable insight into the pathogenesis of viral infections. Experimental infections of sheep have been conducted using blood from BLV-infected cattle, infectious BLV molecular clones or tumor-derived cells. The Fetal Lamb Kidney cell line, persistently infected with BLV (FLK-BLV), is one of the most commonly used long-term culture available for the permanent production of virus. FLK-BLV cells or the viral particles obtained from the cell-free culture supernatant could be used as a source of provirus or virus to experimentally infect sheep. In this report, we aimed to determine the minimum amount of FLK-BLV cells or cell-free supernatant containing BLV needed to produce infection in sheep. We also evaluated the amount of antibodies obtained from a naturally-infected cow required to neutralize this infection. We observed that both sheep experimentally inoculated with 5000 FLK-BLV cells became infected, as well as one of the sheep receiving 500 FLK-BLV cells. None of the animals inoculated with 50 FLK-BLV cells showed evidence of infection. The cell-free FLK-BLV supernatant proved to be infective in sheep up to a 1:1000 dilution. Specific BLV antibodies showed neutralizing activity as none of the sheep became infected. Conversely, the animals receiving a BLV-negative serum showed signs of BLV infection. These results contribute to the optimization of a sheep bioassay which could be useful to further characterize BLV infection.

Resumen El virus de la leucosis bovina (bovine leukemia virus [BLV]) es un importante agente patógeno del ganado que causa importantes pérdidas económicas en todo el mundo, especialmente en los rodeos lecheros. El uso de modelos animales proporciona información valiosa sobre la patogénesis de las infecciones virales. Se realizaron infecciones experimentales en ovejas usando sangre de bovinos infectados con BLV, clones moleculares de BLV infecciosos o células derivadas de tumores. La línea celular Fetal Lamb Kidney, persistentemente infectada con el BLV (FLK-BLV), es uno de los cultivos a largo plazo más utilizados para la producción permanente de virus. Las células FLK-BLV o las partículas virales obtenidas del sobrenadante del cultivo libre de células podrían usarse como fuente de provirus o de virus para infectar experimentalmente ovejas. En este trabajo, nuestro objetivo fue determinar la cantidad mínima de células FLK-BLV o de sobrenadante libre de células que contiene BLV necesaria para producir infección en ovejas. También evaluamos la cantidad de anticuerpos bovinos anti-BLV necesaria para neutralizar la infección. Observamos que las dos ovejas inoculadas experimentalmente con 5000 células FLK-BLV se infectaron, y que una de las dos ovejas que recibieron 500 células FLK-BLV se infectó. Ninguno de los animales inoculados con 50 células FLK-BLV mostró evidencia de infección. El sobrenadante FLK-BLV libre de células demostró ser infectivo en ovejas hasta la dilución 1:1000. Los anticuerpos BLV específicos mostraron actividad neutralizante, ya que ninguna de las ovejas se infectó. Por el contrario, los animales que recibieron un suero BLV negativo mostraron signos de infección por BLV. Estos resultados contribuyen a la optimización de un bioensayo en ovejas útil para caracterizar la infección por BLV.

Frecuencia de anticuerpos contra el virus de la leucosis bovina (VLB) en leche de tanque / Frequency of Antibodies against Bovine Leukosis Virus in Bulk Tank Milk

RESUMEN Objetivo. Determinar presencia de anticuerpos contra VLB en muestras de leche de tanques, en varios departamentos de Colombia. Materiales y métodos. De 2220 muestras llegadas al laboratorio de calidad de la leche de la Universidad de Antioquia para análisis de calidad para pago de una quincena en el mes de mayo de 2016, se seleccionaron 329 al azar y de manera ponderada según el número de muestras disponibles para cada uno de los 7 departamentos participantes. Estas muestras fueron sometidas a la prueba de ELISA para determinar la presencia de anticuerpos contra VLB. Resultados. El resultado principal de este análisis al azar de tanques de leche en busca de anticuerpos contra BLV, fue la positividad de los predios en rangos que oscilan entre el 57 y el 100%; el abordaje de este problema de salud bovina en Colombia es posible mediante las muestras de leche de tanque que rutinariamente llegan a los laboratorios de análisis de calidad. Conclusiones. La infección con BLV está presente en Colombia, el establecimiento de programas de control se podría hacer aprovechando las muestras de leche que se envían de rutina a los laboratorios acreditados para pago.

ABSTRACT Objective. To determine the presence of anti-BLV antibodies in samples from bulk tank milk from several Colombian states. Materials and methods. Out of 2220 samples arriving to the quality milk laboratory from the University of Antioquia in a fortnight period from the month of may 2016, 329 were randomly selected according to the number of samples per each one of the 7 states participating in the study. These samples were run through ELISA test for anti-BLV antibodies. Results. The main result of this random analysis of milk tanks in search of antibodies against BLV was the positivity of the farms in ranks ranging from 57 to 100%; the approach to this bovine health problem in Colombia is possible through the tank milk samples that routinely reach the quality analysis laboratories. Conclusions. The infection with BLV is present in Colombia, the establishment of control programs could be done taking advantage of the samples of milk that are sent routinely to the laboratories accredited for payment.

Clinical and pathological aspects of bovine lymphoma affecting the spinal cord / Aspectos clínicos e patológicos de linfoma bovino afetando a medula espinhal

Clinical and pathological features of bovine lymphoma involving the spinal cord were evaluated through a retrospective study of the necropsy database from 2005 to 2017. Thirty-four cases of bovine lymphoma were found, 24 of which had central nervous system involvement restricted to the spinal cord. All cattle were Holstein cows 2.5-12 years-old (median age, six years-old). The clinical course was 7-21 days, and the main neurological sign was pelvic limb paresis (81.8%). The lymphoma often affected the spinal cord in a multifocal manner. Lumbar segments were the mostly affected sites (23/24), followed by the sacral segments and cauda equina (20/24), cervical (5/24) and thoracic (5/24) segments. Tumors were in the epidural space, peripheral to the pachymeninges (extradural) and between layers of adipose tissue. In addition, two cases had progressive hemorrhagic myelomalacia. Further organs affected included the lymph nodes (100%), abomasum (79.2%), heart (75%) and kidneys (45.8%). Microscopically, all lymphomas had a diffuse pattern, with no meningeal or medullar infiltration. According to the REAL/WHO classification, all these neoplasms were mature B-cell lymphomas. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) was observed in 95.8% (23/24) of the cases. The following subtypes were observed in the DLBCL group in descending order: immunoblastic (60.9%, 14/23), centroblastic (26.1%, 6/23), anaplastic (8.7%, 2/23) and T-cell rich (4.3%, 1/23).(AU)

Os aspectos clínicos e patológicos do linfoma bovino afetando a medula espinhal foram avaliados através de um estudo retrospectivo dos protocolos de necropsia durante o período de 2005-2017. De um total de 34 bovinos com linfoma, 24 apresentaram afecção do sistema nervoso central (SNC) restrito a medula espinhal. Todos os bovinos afetados eram fêmeas, da raça Holandesa, com 2,5 a 12 anos de idade (idade mediana de seis anos). Clinicamente, os casos tiveram uma evolução de sete a 21 dias, com a principal alteração neurológica caracterizada por paresia de membros pélvicos, a qual foi observada em 81,8% dos casos. O linfoma afetou frequentemente a medula espinhal de maneira multifocal. Os segmentos lombares foram os mais envolvidos (23/24), seguidos pelos sacrais e cauda equina (20/24), cervicais (5/24) e torácicos (5/24). Os tumores estavam localizados no espaço epidural, periférica à paquimeninge (extradural) e associada ao tecido adiposo. Em dois casos foi também observada mielomalacia hemorrágica progressiva. Os órgãos acometidos com maior frequência, concomitantemente ao espaço epidural, foram os linfonodos (100%), abomaso (79,2%), coração (75%) e rins (45,8%). Microscopicamente, todos os linfomas exibiam um padrão difuso, sem infiltração em meninges e medula espinhal (extradural). De acordo com a classificação da REAL/WHO, todos esses neoplasmas foram incluídos como linfomas de células B maduras. O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) foi observado em 95,8% (23/24) dos casos. Os subtipos classificados dentro do grupo dos LDGCB's foram em ordem decrescente: imunoblástico (60,9%; 14/23), centroblástico (26,1%; 6/23), anaplásico (8,7%; 2/23), e rico em células T (4,3%; 1/23).(AU)

Performance assessment of imported ELISA in the serodiagnosis of the enzootic bovine leukosis in herds of Pernambuco state, Brazil / Avaliação do desempenho de ELISA importado no sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina em rebanhos do estado de Pernambuco, Brasil

Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease of cosmopolitan distribution and chronic character caused by a virus of the Retroviridae family, bovine leukemia virus (BLV). The epidemiological situation of EBL in Brazil has motivated studies to improve its diagnosis, based on the recommended serological techniques: agar gel immunodiffusion (AGID) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This study was designed to evaluate the use of imported ELISA for the detection of BLV in dairy herds raised in Pernambuco, Brazil, comparing it to AGID. Blood serum samples from 327 dairy cattle from the state of Pernambuco were tested to AGID and the imported commercial ELISA CHEKIT-Leucose-serum, produced by the IDEXX® laboratory for the diagnosis of EBL. Discarding 25 inconclusive samples from one or both tests, 302 samples were analyzed, being 24.1% positive (73/302) in the AGID and 45% (136/302) in the ELISA, which compared to the AGID, a technique considered standard, presented sensitivity of 98.6%, specificity of 72% and Kappa coefficient of 0.55. The lack of agreement in the diagnostic methods was probably due to the high sensitivity of the ELISA, which makes it possible to detect antibodies even in situations with low serum levels. Although AGID has been shown to be an efficient test so far, in more advanced stages of an EBL control and eradication program, with low prevalence rates, ELISA will present better performance, due to its higher sensitivity, avoiding the permanence of animals that spread the disease in the herds.(AU)

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa de distribuição cosmopolita e caráter crônico causada por um vírus da família Retroviridae, o vírus da leucemia bovina (VLB). A situação epidemiológica da LEB no Brasil vem motivando estudos para o aprimoramento do seu diagnóstico, tendo como base as técnicas sorológicas recomendadas: imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA). Este estudo teve como objetivo avaliar o uso de ELISA importado para a detecção do VLB em rebanhos leiteiros criados em Pernambuco, Brasil, comparando-o ao IDGA. Amostras de soro sanguíneo de 327 bovinos leiteiros do estado de Pernambuco foram testadas para IDGA e ELISA comercial importado CHEKIT-Leucose-serum, produzido pelo laboratório IDEXX® para o diagnóstico da LEB. Descartadas 25 amostras inconclusivas de um ou ambos os testes, foram analisadas 302 amostras, sendo 24,1% positivas (73/302) na IDGA e 45% (136/302) no ELISA, que em relação à IDGA, técnica considerada padrão, apresentou sensibilidade de 98,6%, especificidade de 72% e coeficiente Kappa de 0.55. A falta de concordância entre os métodos diagnósticos deveu-se, provavelmente, à elevada sensibilidade do ELISA, que possibilita detectar anticorpos mesmo em situações com baixos teores séricos. Apesar da IDGA se mostrar até o momento um teste eficiente, em etapas mais avançadas de um programa de controle e erradicação da LEB, com baixos índices de prevalência, o ELISA apresentará melhor desempenho, por possuir maior sensibilidade, evitando-se a permanência de animais disseminadores da doença nos rebanhos.​(AU)

Serological status of IBR, BVD, leucosis, Leptospira and Neospora caninum in bovine females of the department of Santander, Colombia / Estado serológico a IBR, DVB, Leucosis, Leptospira y Neospora caninum en hembras bovinas del Departamento de Santander, Colombia

Abstract Objective. To determine the serological status of bovine females for infectious bovine rhinotracheitis (IBR), bovine viral diarrhea (BVD), leucosis, Leptospira and Neospora caninum in the department of Santander, Colombia. Materials and methods. Convenience sampling was conducted on 460 cattle farms in 23 municipalities of Santander (Colombia). The collected sera were analyzed using different commercial ELISA kits following the manufacturer's instructions. Results. Seroreactive animals were found for all diseases studied, with general prevalence rates of 21.8% for leucosis, 26.1% for Leptospira, 29.7% for BVD, 48.2% for IBR and 63% for Neospora. Conclusions. The prevalence rates of the diseases analyzed in the department of Santander among the bovine population fluctuate from medium to high and thus require official control measures.

Resumen Objetivo. Conocer el estado serológico de hembras bovinas a IBR, DVB, leucosis, leptospira y Neospora caninum en el departamento de Santander, Colombia. Materiales y métodos. Se realizó un muestreo por conveniencia en 460 fincas ganaderas de 23 municipios de Santander (Colombia), los sueros colectados fueron analizados mediante diferentes kits comerciales de ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante. Resultados. En todas las enfermedades estudiadas se encontraron animales seroreactores, correspondiendo la prevalencia general a Leucosis 21.8%, Leptospira 26.1%, DVB 29.7%, IBR 48.2% y Neospora 63%. Conclusiones. En el departamento de Santander las enfermedades analizadas se encuentran en la población bovina con prevalencias que fluctúan entre medio a alto, lo cual requiere medidas de control oficial.

Heterogeneity determination of bovine leukemia virus genome in Santa Catarina state, Brazil / Determinação da heterogeneidade do genoma do vírus da leucose enzoótica bovina no estado de Santa Catarina, Brasil

Bovine leukemia virus (BLV) is a member of Retroviridae family, genus Deltaretrovirus, and the main viral agent responsible for economic loses in dairy herds. Some studies have been carried out about BLV genotypes, and at least seven genotypes were found out in samples of different regions of the world. The objective of this study was to identify BLV samples from seropositive dairy cattle in Santa Catarina state, Brazil, using molecular techniques. Blood samples were collected (454) from dairy cattle from 31 different farms, and serology using agar gel immunodiffusion test (AGID) was performed. After that, 191 seropositive samples were submitted to DNA extraction, and in 77 samples the polymerase chain reaction (PCR) for amplification of a 440 bp fragment of the env gene was performed. Nineteen DNA samples were subjected to restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis by digestion of the PCR fragment by five restriction endonucleases - BamHI, HaeIII, Tru9I, TaqI, and MwoI. It was found 42% seropositive animals (191/454) and 68% positives of the farms (21/31). The PCR showed 80.5% (62/77) of animals positive. The RFLP analysis identified five different genotypes dispersed by Santa Catarina state, with the highest prevalence for genotype X (47.4%). Overall, our results identified the viral genotypes present in dairy cattle and the prevalence of new variants in representative farms from Santa Catarina state.(AU)

O bovine leukemia virus (BLV) é um membro da família Retroviridae, gênero Deltaretrovirus, e o principal agente viral causador de perdas econômicas em rebanhos leiteiros. Diversos estudos têm sido feitos sobre os genótipos de BLV, e foram encontrados pelo menos sete em amostras de diferentes partes do mundo. O objetivo deste estudo foi realizar a caracterização molecular de amostras de BLV de bovinos leiteiros soropositivos no estado de Santa Catarina. Foram coletadas 454 amostras de sangue de bovinos de 31 propriedades, e fez-se inicialmente a sorologia por meio do teste de imunodifusão em gel de ágar. Após a sorologia, 191 amostras soropositivas foram então submetidas à extração de DNA, e em 77 amostras se realizou a reação da polimerase em cadeia (PCR), para a amplificação de um fragmento de 440 pb do gene env. Dezenove amostras foram submetidas à análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição por digestão do fragmento da PCR por cinco enzimas de restrição: BamHI, HaeIII, Tru9I, TaqI e MwoI. Os resultados obtidos na sorologia apontaram 42% de animais soropositivos (191/454) e 68% de propriedades positivas (21/31). Na PCR, 80,52% (62/77) dos animais apresentaram-se positivos. A análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição identificou cinco genótipos circulantes no estado, e a maior prevalência foi observada no genótipo X (47,4%). Este estudo permite-nos conhecer alguns dos genótipos virais presentes em bovinos leiteiros do estado de Santa Catarina, bem como identificar a existência de novas variantes e sua prevalência atual, e os resultados são úteis para futuros estudos epidemiológicos.(AU)

Development of an indirect ELISA based on recombinant capsid protein to detect antibodies to bovine leukemia virus

Abstract Serological testing and culling infected animals are key management practices aiming eradication of bovine leukemia virus infection. Here, we report the development of an indirect ELISA based on BLV recombinant capsid protein (BLVp24r) to detect anti-BLV antibodies in cattle serum. The BLVp24r was expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography, and then used to set up the ELISA parameters. The Polysorp ® plate coated with 50 ng of antigen/well and bovine serum diluted 1:100 gave the best results during standardization. Using sera from infected and non-infected cattle we set up the cutoff point at 0.320 (OD450 nm) with a sensitivity of 98.5% and specificity of 100.0%. Then, we tested 1.187 serum samples from dairy (736 samples) and beef cattle (451 samples) with unknown status to BLV. We found that 31.1% (229/736) and 9.5% (43/451) of samples amongst dairy and beef cattle, respectively, had IgGs to BLV. The rate of agreement with a commercial competitive ELISA was 84.3% with a κ value of 0.68. Thus, our BLVp24r iELISA is suitable to detect BLV infected animals and should be a useful tool to control BLV infection in cattle.

Imunidade celular em vacas Holandesas soropositivas para o Vírus da Leucose Bovina (BLV) durante o período de transição / Cellular immunity in Holstein cows seropositive for Bovine Leukosis Virus (BLV) during the transition period

Esta pesquisa avaliou a dinâmica dos leucócitos e das subpopulações de linfócitos em vacas Holandesas soropositivas para o BLV no período de transição. Amostras de sangue (n=72) provenientes de 12 vacas foram coletadas entre as semanas -2 e +3 para a realização do leucograma, imunofenotipagem, dosagem de cortisol e haptoglobina (Hp). O perfil leucocitário foi caracterizado por leucocitose, neutrofilia, monocitose e eosinopenia próximo ao parto. Linfocitose e elevada proporção de linfócitos B CD21+ foram achados constantes entre as semanas -2 e +3; assim, as vacas foram testadas e confirmadas soropositivas para o BLV. Os valores das subpopulações de linfócitos T apresentaram-se baixos durante o período de transição, observando-se dois picos máximos que coincidiram com as elevações nas concentrações de cortisol no parto (2,11µg/dL) e semana +3 (1,97µg/dL). Hp apresentou aumento crescente de -2 (166µg/mL) a +3 (576µg/mL), provavelmente associada à elevada taxa de infecções uterinas observadas nas semanas +2 e +3. As vacas soropositivas para o BLV apresentaram leucograma de estresse próximo ao parto, exceto para linfócitos. A linfocitose e as elevadas proporções de células B CD21+, associadas com as baixas proporções de células T, podem ser indicativo de imunossupressão e predisposição aos processos inflamatórios no período pós-parto.(AU)

This research evaluated the dynamics of leukocytes and lymphocytes subsets in seropositive Holstein cows for BLV during the transition period. Blood samples (n=72) from 12 cows were harvested from week -2 up to week +3 to perform leukogram, immunophenotyping, cortisol and haptoglobin (Hp). Leukocytes pattern was characterized by leukocytosis, neutrophilia, monocytosis and eosinopenia around calving. Lymphocytosis and high proportions of B cells CD21+ were a constant finding between week -2 and +3, thus cows were tested and confirmed seropositive for BLV. The values of T lymphocytes subsets were low during the transition period, observing two peaks that coincided with high levels of cortisol at delivery (2.11µg/dL) and week +3 (1.97µg/dL). Hp had gradual increase from week -2 (166µg/mL) until week +3 (576g/mL) probably due to high rate of uterine infection detected between week +2 and +3. The seropositive cows for BLV presented stress leukogram around delivery, except for lymphocytes. Lymphocytosis and the high proportions of B cells, associated with the low proportions of T lymphocytes, can be indicative of immunosuppression and predisposition to the inflammatory process observed in the post-partum period.(AU)

Neoplasmas bovinos diagnosticados no Setor de Patologia Veterinária da UFRGS, Porto Alegre (2005-2014) / Bovine neoplasms diagnosed in the Sector of Veterinary Pathology of UFRGS, Porto Alegre, Brazil (2005-2014)

Realizou-se um estudo retrospectivo com o objetivo de determinar os tipos de neoplasmas em bovinos e a sua frequência. Foram analisados os casos de necropsias e biopsias de bovinos com diagnóstico de neoplasia, submetidos ao Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS), entre janeiro de 2005 e dezembro de 2014. De um total de 4.188 exames realizados em bovinos, 154 foram diagnosticados como neoplasmas. Destes, 100 casos foram a causa da morte, 41 foram achados de frigorífico e 13 casos eram biopsias de cirurgias realizadas por veterinários de campo. Os neoplasmas ocorreram com maior frequência em bovinos adultos (96/154), fêmeas (125/154) e a raça mais acometida foi a Holandesa (79/154). Os neoplasmas mais frequentes foram linfoma (73/154), carcinoma de células escamosas (28/154), papiloma (9/154), melanoma (6/154) e feocromocitoma (6/154). Os sistemas mais acometidos foram o hemopoiético (75/154) e tegumentar (25/154). Conclui-se que o linfoma e o carcinoma de células escamosas são os neoplasmas mais frequentes em bovinos diagnosticados no SPV-UFRGS, Brasil.(AU)

A retrospective study has been conducted with the objective of determining the types of bovine neoplasms and their frequency. Necropsy and biopsy cases with diagnosis of neoplasm in cattle submitted to the Setor de Patologia Veterinária of Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS) from January 2005 to December 2014 were analyzed. A total of 4,188 exams were performed in cattle, and 154 were diagnosed as neoplasm. From these 154 occurrences, 100 cases of neoplasm were the cause of death, 41 were collected from cattle in slaughter house and 13 were biopsies sent by field veterinarians. Neoplasms occurred more frequently in adult cattle (96/154), females (125/154) and the most affected breed was Holstein-Friesian (79/154). The most common neoplasms were lymphoma (73/154), squamous cell carcinoma (28/154), papilloma (9/154), melanoma (6/154) and pheochromocytoma (6/154). The most affected systems were hemopoietic (75/154) and integumentary (25/154). We concluded that lymphoma and squamous cell carcinoma are the most common neoplasms in cattle diagnosed in SPV-UFRGS, Brazil.(AU)

Classificação de 86 casos de linfoma em bovinos de acordo com a Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage e a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL) / Classification of 86 bovine lymphomas cases according to the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage and The Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL)

Por meio de um estudo retrospectivo, realizou-se avaliação fenotípica (histologia) e imunofenotípica (imuno-histoquímica [IHQ]) de 86 casos de linfoma bovino. Quanto ao padrão de distribuição, todos os linfomas foram incluídos como difusos. Em relação à dimensão dos linfócitos neoplásicos, 83,8% dos linfomas foram considerados como de grandes células e 11,6% como de pequenas células. Linfomas mistos, ou seja, constituídos por grandes e pequenas células, representaram apenas 4,6% dos casos. Quanto ao número de mitoses, 84,9% dos linfomas foram incluídos como de grau intermediário, 10,5% como de baixo grau e 4,6% como de alto grau. No que se refere à morfologia do núcleo, linfomas em que predominavam linfócitos não clivados (58,2%) ou linfócitos clivados (37,2%) foram mais frequentes do que aqueles em que havia uma mistura igualmente proporcional de linfócitos clivados e não clivados (4,6%). Com base nestes resultados, os 86 linfomas foram assim distribuídos utilizando-se a classificação proposta pela Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage: difuso de grandes células não clivadas (46,5%), difuso de grandes células clivadas (33,7%), difuso de pequenas e grandes células (4,6%), difuso de pequenas células - tipo plasmocitoide (7%), imunoblástico (3,5%), difuso de pequenas células - tipo intermediário (2,3%), difuso de pequenas células não clivadas (1,2%) e difuso de pequenas células não clivadas - tipo Burkitt (1,2%). Na imuno-histoquímica, 27 dos 86 (31,4%) linfomas foram positivos para o anticorpo monoclonal CD79αcy, utilizado para detecção de linfócitos B, e nenhum caso foi positivo para o anticorpo policlonal CD3, utilizado para detecção de linfócitos T. Com base nestes resultados, os 27 linfomas B foram assim distribuídos utilizando-se a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL): linfoma difuso de grandes células B (81,5%), linfomas imunoblásticos de grandes células (11,1%) e linfomas...

A retrospective study of 86 cases of bovine lymphoma classified as with diffuse pattern of distribution and verified by phenotypic (histology) and immunophenotypic (immunohistochemistry [IHC]) is presented. Regarding the size of the neoplastic lymphocytes, 83.8% was classified as large cells lymphoma and 11.6% as small cells lymphoma. Mixed lymphomas, i.e., formed by large and small cells simultaneously represented only 4.6% of all cases. Regarding their mitotic index, 84.9% of lymphomas was included in the intermediate-grade, 10.5% as low-grade and 4.6% as high-grade. Regarding the nucleus morphology, lymphomas with mostly non-cleaved cells (58.2%) or cleaved cells (37.2%) were the more frequent than those with a balanced mixed proportion of cleaved and non-cleaved cells (4.6%). Based on these results, the 86 lymphoma cases were classified by the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage as: diffuse large non-cleaved cell (46.5%), diffuse large cleaved cell (33.7%), diffuse mixed small and large cell (4.6%), diffuse small cell - plasmacytoid (7%), immunoblastic (3.5%), diffuse small cell - intermediate (2.3%), diffuse small non-cleaved cell (1.2%), and diffuse small non-cleaved cell Burkitt's (1.2%). According to the IHC, 27 out of 86 (31.4%) lymphomas were positive to monoclonal antibody CD79αcy, used to detect B cells, and none were positive for polyclonal antibody CD3, used to detect T cells. Based on this, the 27 B-cell type lymphomas were distributed as follows: diffuse large B-cell lymphoma (81.5%), large cell immunoblastic lymphoma (11.1%), and lymphoplasmacytoid lymphoma...

Intercorrência entre leucose enzoótica e tuberculose em bovinos abatidos em frigorífico / Intercurrence between enzootic leukosis and tuberculosis in slaughtered bovine in slaughterhouses

Leucose e tuberculose são doenças que acometem o rebanho bovino e acarretam consideráveis prejuízos econômicos, em virtude do impacto na produtividade, porém há poucos relatos de que elas ocorram concomitantemente. Diante disso, objetivou-se avaliar a intercorrência entre essas doenças em bovinos abatidos no município de São Gotardo, MG, sendo que esses animais foram reagentes à tuberculinização e apresentaram lesões características da doença durante o abate sanitário. Cento e trinta e três amostras de soro sanguíneo, todas oriundas de bovinos positivos para tuberculose, foram analisadas pela técnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), e a prevalência de bovinos que apresentaram positividade ao teste de IDGA foi de 55,64% (74/133). Os resultados obtidos nesta pesquisa permitiram concluir que a tuberculose e a leucose são doenças presentes nas regiões estudadas e encontram-se disseminadas na população avaliada, com níveis significativos, causando risco à saúde dos animais e das pessoas, dado o caráter zoonótico da tuberculose bovina.(AU)

Leukosis and tuberculosis are diseases that affect cattle and entail considerable economic losses, due to theim pact on productivity, but there are few reports that they occur simultaneously. Therefore, aimed to evaluate the complications of these diseases in cattles laughtered in São Gotardo, MG, these animals were positive to the tuberculin and showed lesions characteristic of the disease during the stamping. One hundred and thirty three samples of blood serum, all from positive to bovine tuberculosis, were analyzed by immuno diffusion technique in agar gel (AGID), and the prevalence of cattle that were positive by AGID test was 55.64% (74/133). The results of this research showed that tuberculos is and leukosis are diseases present in the studied regions and are disseminated in this population, with significant levels, causing risk to the health of animals and people, as the zoonotic bovine tuberculosis.(AU)

Development and evaluation of an immunochromatographic assay using a gp51 monoclonal antibody for the detection of antibodies against the bovine leukemia virus

Infection of cattle with bovine leukemia virus (BLV) has been observed and reported worldwide, including in Korea. The onsite identification of infected cattle would help decreasing and eradicating BLV infections on farms. Here, we present a new immunochromatographic assay that employs monoclonal antibodies (MAbs) for the detection of antibodies against BLV in the field. BLV envelope glycoprotein (gp)51 was expressed in E. coli, and MAbs against recombinant BLV gp51 were generated for the development of an immunochromatographic assay to detect BLV antibodies in cattle. The sensitivity and specificity of the assay were determined by comparing these results with those obtained from a standard enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). A total of 160 bovine sera were used to evaluate the new immunochromatographic assay. Using ELISA as a reference standard, the relative specificity and sensitivity of this assay were determined to be 94.7% and 98%, respectively. Because of its high sensitivity and specificity, this BLV antibody detection assay would be suitable for the onsite identification of BLV infection in the field.

Ocorrência de anticorpos antivírus da leucose enzoótica bovina em animais da região médio-norte mato-grossense, Brasil / Enzootic bovine leukosis antibodies in cattle from mid-northern Mato Grosso State, Brazil

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma enfermidade causada por um retrovírus e pode apresentar um quadro de linfocitose persistente ou linfossarcomas em bovinos adultos. Este estudo teve como objetivo realizar um levantamento sorológico, por meio do teste de imunodifusão em gel agar (IDGA), de bovinos de corte e de leite, bem como de animais puros de origem (POs), criados nos municípios de Sinop e Sorriso, a fim de se conhecer a distribuição e a ocorrência de anticorpos antivírus da LEB na referida região. De acordo com os resultados obtidos, foi verificado que a prevalência acumulada nas três categorias foi de 11,78% de soropositivos, sendo 12,19% para bovinos de corte, 11,20% para o rebanho leiteiro e 9,09% em animais POs. Dessa forma, este estudo demonstrou que a LEB se faz presente no estado de Mato Grosso, sendo possível verificar que a LEB apresenta índices de prevalência abaixo dos encontrados em outras regiões do país.(AU)

The enzootic bovine leukosis (EBL) is a disease caused by a retrovirus and can be presented as a persistent lymphocytosis, or bovine lymphosarcomas in adult cattle. This study aimed to conduct a serological survey of beef cattle, dairy herd and in purebred cattle raised in the cities of Sinop and Sorriso, in order to understand the distribution and occurrence of antibodies anti-EBL virus in that region. According to the results obtained, the prevalence in the three categories was 11.78% of serum positives, where 12.19% for beef cattle, 11.02% for the dairy herd and 9.09% in purebred cattle animals. Thus, this study demonstrated that EBL is present in Mato Grosso State, and EBL's prevalence rates lower than others reported in several regions of the country.(AU)

Genetic analysis of env and gag gene fragments of bovine leukemia virus identified in cattle from Korea / 대한수의학회지

Bovine leukemia virus (BLV) is the causative agent of enzootic bovine leukosis. This study was conducted to clarify the molecular characteristics of BLVs obtained from a specific region in Korea. Proviral BLVs were detected in anti-BLV antibody-positive blood samples by PCR. Env and gag fragments were sequenced and compared to previously published reference sequences. Analysis of the env gene sequence revealed that the YI strain was highly similar to genotype 1, including United States and Japanese strains. The gag gene sequence had the highest degree of similarity with a Japanese strain.

Case of Sporadic T-cell Lymphosarcoma in Cattle / 동물의과학연구지

We would like to report a case of bovine lymphosarcoma. Parous cattle from a livestock farmhouse were examined for mutinodular masses in the abdominal cavity after slaughter. For clinical signs, animals presented mild leukemic signs but did not have viral or bacterial infection. Grossly, whitish to yellowish smooth masses similar to fat tissue were covered with a thin membrane. A multilobulated mass formed around the arteri, and there was a large quantity of reddish fluid on the cut surface. Histopathologically, a monomorphic population of lymphocytes was observed along with small amounts of cytoplasm, round nuclei with coarsely granular chromatin, and numerous mitotic figures in the samples. In the tumor lesion, uniformly round cells had invaded with abundant neovascularization. Especially, the immunohistochemical phenotype of tumor cells was positive for anti-CD3 and negative for anti-CD8 and anti-CD20. Therefore, morphological analysis diagnosed the mass as a multinodular bovine lymphosarcoma of T-cell origin without any sign of infection by a viral agent.

Enzootic bovine leucosis ­ a case report / Leucose enzoótica bovina ­ relato de caso

Enzootic bovine leucosis is an infectious disease of cattle caused by the bovine leukemia virus that results in lymphoma within target tissues. Cattle might demonstrate four clinicopathological age-related manifestations of the disease: juvenile, adult, thymic, and cutaneous form. This article describes the unusual manifestation of this disease in a 4-yr-old cow. Regional lymph nodes were enlarged during clinical examination. Peripheral and internal lymph nodes, as well as the vagina, uterus, spleen, liver, heart, thoracic vertebrae, eye and the thoracic and abdominal cavities demonstrated lymphoma at necropsy. Bovine enzootic leucosis was confirmed by histopathology and agar gel immunodifusion.

A leucose enzoótica bovina é uma doença infecciosa de bovinos causada pelo vírus da leucemia bovina que produz linfoma em tecidos alvos. Bovinos podem demonstrar quatro manifestações clínico-patológicas da doença relacionadas à idade: forma juvenil, adulta, tímica e cutânea. Esse artigo descreve a manifestação incomum dessa doença em uma vaca de quatro anos de idade. Os linfonodos regionais apresentaram-se aumentados no exame clínico. Linfoma foi observado nos linfonodos periféricos e internos bem como na vagina, útero, baço, fígado, coração, vértebras torácicas, olho e nas cavidades torácica e abdominal durante a necropsia. A leucose enzoótica bovina foi confirmada na histopatologia e pela imunodifusão em gel de ágar.

Intercorrência entre leucose enzoótica e brucelose em búfalos (Bubalus bubalis) em sistema de produção extensivo / Intercurrence of enzootic leucosis and brucellosis in buffaloes (Bubalus bubalis) in extensive production system

Objetivou-se com este estudo avaliar a intercorrência entre leucose enzoótica e brucelose em búfalos (Bubalus bubalis) em sistema de produção extensivo, pelo estabelecimento da prevalência de bubalinos reagentes às provas diagnósticas específicas. Foram analisados sorologicamente 232 animais, pela técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose para diagnóstico de leucose enzoótica e o teste do antígeno acidificado tamponado, seguida pelos testes confirmatórios 2-mercaptoetanol e soroaglutinação lenta em tubos para diagnóstico de brucelose. As prevalências de búfalos que apresentaram positividade para leucose e brucelose foram 4,21% (10/232) e 5,18% (12/232), respectivamente. Os resultados obtidos nesta pesquisa permitiram concluir que as infecções estudadas encontram-se presentes na população avaliada, entretanto, com baixa prevalência e sem dependência de ocorrência entre ambas.

This study was carried out to evaluate the intercurrence of brucellosis and enzootic leucosis in buffaloes in extensive production system by establishing the prevalence of reagent buffaloes for specific diagnostic tests. We analyzed 232 animals serologically by the technique of double immunodiffusion in agarose gel (AGID) for diagnostic of leucosis and the tampon acidified antigen (TAA) test, followed by confirmatory tests of 2-mercaptoethanol (2-ME) and slow serum agglutination (SSA) in tubes for diagnostic of brucellosis. The prevalence of buffaloes that were positive for leucosis and brucellosis tests were 4.21% (10/232) and 5.18%(12/232) respectively. The results of this investigation indicated that the diseases occur in the population studied, however, with low prevalence and without depending on the occurrence of both.