Caracterização molecular e análise da expressão gênica da LaNTPDase-1 em Leishmania amazonensis / Molecular characterization and analysis of LaNTPDase-1 gene expression in Leishmania amazonensis

O presente trabalho trata de um estudo sobre as enzimas nucleotideo trifosfato difosfohidrolase de Leishmania (Leishmania) amazonensis (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase - LaNTPDase), um dos principais agentes etiológicos da leishmaniose difusa no Brasil. O desenho experimental do estudo contempla uma abordagem estrutural in silico e uma abordagem experimental de expressão genica do gene codificante desta enzima nos promastigotas e amastigotas do parasito. No estudo foi elucidada a sequência nucleotídica codificante correspondente à NTPDase de L. amazonensis. A sequência obtida foi alinhada com NTPDases de outras espécies do gênero Leishmania. Com os ensaios foi possível propor que esta enzima pode estar ligada à membrana plasmática por um domínio transmembranar, sendo denominada NTPDase-1. A estrutura terciária da enzima foi proposta por modelagem por homologia, indicando importantes diferenças estruturais, especialmente na região de ligação aos nucleotídeos. Expressão heteróloga da enzima de L. amazonensis (rLaNTPDase-1) foi realizada indicando uma proteína de 45 kDa em condições desnaturantes.

Em paralelo, avaliamos a modulação da expressão gênica da LaNTPDase-1 entre dois isolados de L. amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8 e MHOM/BR/77/LTB0016), com distintos percentuais de infectividade em macrófagos de camundongos BALB/c cepa PH8 (31,0%±6,3) e cepa LTB0016 (18,2%± 5,3) e perfis diferentes das fases logarítmica e estacionarias de crescimento in vitro dos promastigotas. Observamos que durante a curva de crescimento, somente a cepa PH8 apresentou um aumento na expressão do gene no quarto dia de cultivo (4,3±2), quando comparado com a LTB0016. A expressão da LaNTPDase-1 mostrou-se aumentada nos amastigotas, quando comparada com os promastigotas da cepa PH8 (>5,2±0,8) e da cepa LTB0016 (>0,8±0,5). Os resultados aqui apresentados indicam que o parasito L. amazonensis expressa o gene correspondente a enzima NTPDase-1, sendo que este gene é mais ix expresso nos amastigotas do que nos promastigotas. Estes resultados reforçam a importância desta enzima na fase do parasito quando no hospedeiro vertebrado. (AU)

Análise da expressão do gene TcNTPDase-1 em diferentes subpopulações e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi / Gene expression analysis of tcntpdase-1 in the distinct subpopulation and evolutive forms of trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoßrio parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em ßreasendêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e suadistribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestaçõesclínicas, resposta ao diagnóstico e eficßcia terapêutica. A ecto-NTPDase é umaenzima localizada na superfície externa da membrana plasmßtica do T.cruzi, quehidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado estaenzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papelimportante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos osníveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados doparasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014-T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) einfectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Realforam realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequênciade 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDHforam utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 eLL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que oclone CL-14, avirulento...

Chagas disease is a neglected illness caused by the parasite protozoanTrypanosoma cruzi, which affects 6-8 million people in endemic areas of LatinAmerica. The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regionaldistribution, have been suggested to cause different clinical manifestations andtherapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto-NTPDase is an apyrase locatedon the outer surface of T.cruzi plasma membrane- that hydrolyzes tri- and/or diphosphatenucleotides. Previous studies related this enzyme to the infectivity andvirulence of the parasite, and suggest an important role in the uptake of purines. Inthis study, we evaluate the mRNA levels for the ecto-NTPDase I by RT-PCR indistinct isolated parasites (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167-T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulent), in non-infective forms(epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes). The RealTime PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111bpsequence in the TcNTPDase-1 gene and, as endogenous controls, a 268bpsequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the TcGAPDH genewere used. We observed that the epimastigotes of strains Y, 3663, 4167 e LL014expressed the same levels of the gene of TcNTPDase-1 that the CL-14 clone,avirulent...

NTPDase and acetylcholinesterase activities in silver catfish, Rhamdia quelen (Quoy & Gaimard, 1824) (Heptapteridae) exposed to interaction of oxygen and ammonia levels

The effects of various levels of oxygen saturation and ammonia concentration on NTPDase (ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase, E.C. 3.6.1.5) and acetylcholinesterase (AChE, E.C. 3.1.1.7) activities in whole brain of teleost fish (Rhamdia quelen) were investigated. The fish were exposed to one of two different dissolved oxygen levels, including high oxygen (6.5 mg.L-1) or low oxygen (3.5 mg.L-1), and one of two different ammonia levels, including high ammonia (0.1 mg.L-1) or low ammonia (0.03 mg.L-1) levels. The four experimental groups included the following (A) control, or high dissolved oxygen plus low NH3; (B) low dissolved oxygen plus low NH3; (C) high dissolved oxygen plus high NH3; (D) low dissolved oxygen plus high NH3. We found that enzyme activities were altered after 24 h exposure in groups C and D. ATP and ADP hydrolysis in whole brain of fish was enhanced in group D after 24 h exposure by 100 percent and 119 percent, respectively, compared to the control group. After 24 h exposure, AChE activity presented an increase of 34 percent and 39 percent in groups C and D, respectively, when compared to the control group. These results are consistent with the hypothesis that low oxygen levels increase ammonia toxicity. Moreover, the hypoxic events may increase blood flow by hypoxia increasing NTPDase activity, thus producing adenosine, a potent vasodilator.(AU)

No presente estudo, avaliou-se o efeito de diferentes níveis de saturação de oxigênio e amônia sobre a atividade das enzimas NTPDase (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase, E.C. 3.6.1.5) e acetilcolinesterase (AChE, E.C. 3.1.1.7) em encéfalo total de jundiás (Rhamdia quelen). Os peixes foram expostos a diferentes níveis de oxigênio dissolvido e amônia, níveis altos de oxigênio (6,5 mg/L) ou baixos de oxigênio (3,5 mg/L), e níveis altos de amônia (0,1 mg/L) ou baixos de amônia (0,03 mg/L). Os peixes foram divididos em quatro diferentes grupos: (A) controle ou alto nível de oxigênio dissolvido mais baixo nível de NH3; (B) baixo nível de oxigênio dissolvido mais baixo nível de NH3; (C) alto nível de oxigênio dissolvido mais alto nível de amônia; (D) baixo nível de oxigênio dissolvido mais alto nível de NH-3. As atividades de ambas as enzimas nos grupos C e D somente foram alteradas após 24 horas de exposição. A hidrólise do ATP e ADP em encéfalo total de jundiás foi aumentada após 24h de exposição para 104 por cento e 155 por cento no grupo D quando comparado ao grupo controle, respectivamente. A atividade da AChE apresentou após 24h de exposição um aumento de 37 por cento no grupo C e 27 por cento no grupo D, ambos comparados ao grupo controle. Os resultados obtidos corroboram com a hipótese que baixos níveis de saturação de oxigênio aumentam a toxicidade da amônia. Além disso, os eventos de hipóxia podem aumentar o fluxo sanguíneo, e este evento aumenta a atividade da NTPDase produzindo adenosina, um potente vasodilatador(AU)

Change of enzyme activity correlation with nucleic acid metabolism during the vascular intimal hyperplasia / 中国应用生理学杂志

<p><b>AIM AND METHODS</b>To determine the relationship between the nuclear envelope nucleoside triphosphatase (EC 3. 6. 1. 15, NTPase) activity and the phenotypic modulation of vascular smooth muscle cell (VSMC), the NTPase activity was detected during restenosis after de-endothelialization in vascular wall. The activities of three enzymes involved in carbohydrate and nucleic acid metabolism were also investigated by spectrophotometry.</p><p><b>RESULTS</b>The activity of NTPase increased continuously and associated with the process of intimal thickening. Western blotting showed that expression of SMalpha-actin, as the marker of contractile phenotype of VSMC, decreased continuously. Osteopontin (OPN), the marker of synthetic phenotype of VSMC, was up-regulated during the process. These suggested that intimal injury induced phenotypic modulation of VSMC. The activities of 5'-nucleotidase, adenosine deaminase and succinate dehydrogenase increased and reached their peaks on 7 days after de-endothelialization. The changes of three enzymes were associated with proliferation in VSMC.</p><p><b>CONCLUSION</b>The efflux of mRNA and the changes of enzyme activity involved in carbohydrate or nucleic acid metabolism may be the biochemical basis in the development and progression of restenosis.</p>