Use of nonradioactive labeling to detect large gene rearrangements in 21-hydroxylase deficiency

OBJETIVO: Padronizar a técnica de Southern blotting usando hibridização com material não radioativo para detectar grandes rearranjos no gene CYP21A2 em uma amostra da população brasileira com hiperplasia adrenal congênita. MÉTODO: Foram estudados 42 pacientes, 2 dos quais aparentados, totalizando 80 alelos não relacionados. As amostras de DNA foram obtidas de sangue periférico, digeridas com enzima de restrição Taq I, realizado Southern blotting e hibridizadas com sonda marcada com biotina. RESULTADOS: O método se mostrou eficaz, com resultados similares aos encontrados ao utilizar a metodologia com material radioativo. Foram encontradas 2,5% de deleção do CYP21A2, 8,8% de grandes conversões, 3,8% de deleção do CYP21A1P e 6,3% de duplicação do CYP21A1P. Estas freqüências foram similares às encontradas em nosso estudo prévio, onde um número significante de casos foi estudado. Um bom padrão de hibridização foi alcançado utilizando menor quantidade de DNA (5mg) e a emissão de sinais foi observada entre 5 minutos e 1 hora de exposição. CONCLUSÕES: Padronizamos uma técnica de Southern blotting/ hibridização com material não radioativo (biotina) para a pesquisa de grandes rearranjos no gene CYP21A2 com bons resultados. Apesar de ser mais trabalhoso, este método é mais rápido, utiliza menores quantidades de DNA e, principalmente, evita problemas com o uso de radioatividade.

A 500 MHz proton NMR study of interaction of tripeptides Lys-Tyr-Lys and Lys-Phe-Lys with deoxydinucleotide d-CpG.

The binding of di- and tetranucleotides with tri- and tetrapeptides containing Tyr, Trp, Phe having lysine on both ends has been studied using a 500 MHz proton NMR. The results show that d-CpG exists as a right-handed B-DNA structure with both sugars in 01'-endo sugar conformation and glycosidic bond angle as in anti domain. On binding to tripeptide Lys-Tyr-Lys, the Tyr ring protons shift upfield by 0.015 ppm at 285 degrees K, while the conformation of d-CpG remains unchanged. Change in chemical shift of Tyr and nucleotide protons decreases with temperature. This upfield shift is attributed to stacking with bases/base-pairs. The presence of intermolecular NOE's also supports this. Results of binding of d-CpG to Lys-Phe-Lys are similar to those with Lys-Tyr-Lys except that the chemical shift changes occur to a lesser extent. On comparing the results obtained with three different peptides, it is found that interaction decreases in the order Trp > Tyr > Phe which is similar to that found by theoretical energy calculations (reported elsewhere) and fluorescence measurements. The results also exhibit a specificity in recognition of these amino acid residues by dinucleotides.