Modificações pós-traducionais durante o processo de amastigogênese do Trypanosoma cruzi / Post-translational modifications during the amastigogenesis of Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi constituindo-se em um problema de saúde pública em vários países da América Latina. No seu complexo ciclo de vida, o protozoário passa por quatro estágios diferentes: tripomastigota metacíclica, amastigota, tripomastigota sanguíneo e epimastigota, que permitem sua sobrevivência nos diferentes ambientes com os quais o parasita entra em contato. A diferenciação dos tripomastigotas de T. cruzi em amastigotas (amastigogênese) ocorre com grandes mudanças morfológicas, estruturais e metabólicas no parasita e pode ser reproduzido in vitro por exemplo, pela acidificação do meio extracelular. Apesar dos vários trabalhos descritos na literatura, o processo ainda não é totalmente compreendido. A participação de NO na transdução de sinal durante a amastigogênese, sugerida por dados não publicados de nosso grupo, assim como a via de sinalização dependente de AMPc, foram o foco do presente estudo. A indução da amastigogênese foi obtida por incubação de tripomastigotas em meio de cultura acidificado (pH 6,0) e os parâmetros estudados comparados com parasitas controle (meio de cultura, pH 7,4). Estudamos a variação no perfil de nucleotídios cíclicos (AMPc, GMPc), de quinases (PKA, MAPK- ERK1/2), de uma fosfatase (PP2A), assim como o perfil de proteínas fosforiladas, S-nitrosiladas e nitradas até 6 h do início da amastigogênese. O processo foi dividido nas etapas: inicial (até 60 minutos) e tardio (em torno de 3-4 h), caracterizados por um aumento de formas amastigotas na etapa tardia. Houve um aumento de aproximadamente 17 vezes no nível de AMPc nos primeiros 15 minutos da amastigogênese (meio pH 6,0), seguido por aumento discreto no nível de PKA fosforilada, utilizado como indicador de atividade enzimática, este mais evidente na etapa tardia (360 minutos). Quanto à subunidade catalítica fosforilada da MAPK (ativa), há uma aparente diminuição no nível de fosforilação na fase inicial (30 minutos) e aumento na etapa tardia (120 minutos) do processo de amastigogênese. Quanto ao perfil geral de fosforilação de proteínas, há uma diminuição de fosforilação em torno de 30 minutos, seguida de aumento de fosforilação em proteínas de aproximadamente 5 e 100 kDa, mas de maneira geral, não se observaram grandes mudanças nesse perfil com a metodologia utilizada. Quanto às modificações por NO e seus derivados, foram observadas modificações por S-nitrosilação e nitração das proteínas, além do aumento de GMPc em torno de 60 minutos. Embora essas modificações modulem a atividade biológica de uma grande diversidade de proteínas, seu papel biológico não foi explorado.8 Em resumo, nossos resultados apontam para uma variação no perfil de fosforilação, S-nitrosilação e nitração de proteínas, além do aumento de AMPc e GMPc ao longo do processo de amastigogênese in vitro, com a via de sinalização dependente de quinases/ fosfatases e de óxido nítrico ocorrendo ao longo do processo de amastigogênese

Chagas disease is a neglected disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi and is a public health problem in several Latin American countries. In its complex life cycle, the protozoan goes through four different stages: metacyclic trypomastigote, amastigote, blood trypomastigote and epimastigote, which allow its survival in the different environments which the parasite comes into contact. The differentiation of T. cruzi trypomastigotes into amastigotes (amastigogenesis) occurs with large morphological, structural and metabolic changes in the parasite and can be reproduced in vitro by, for example, acidification of the extracellular medium. Despite the many data described in the literature, the process is not yet fully understood. The participation of NO in signal transduction during amastigogenesis, suggested by unpublished data from our group, as well as the cAMP-dependent signaling pathway, were the focus of the present study. The induction of amastigogenesis was obtained by incubating trypomastigotes in acidified culture medium (pH 6.0) and the studied parameters compared with control parasites (culture medium, pH 7.4). We studied the variation in the profile of cyclic nucleotides (cAMP, cGMP), kinases (PKA, MAPK-ERK1 / 2), phosphatase (PP2A), as well as the profile of phosphorylated, S-nitrosylated and nitrated proteins up to 6 h. onset of amastigogenesis. The process was divided into early (up to 60 minutes) and late (around 3-4 hours), characterized by an increase in amastigote forms in the late stage. There was an approximately 17-fold increase in cAMP level in the first 15 minutes of amastigogenesis (pH 6.0 medium), followed by a slight increase in phosphorylated PKA level, most evident in the late stage (360 minutes). As for the phosphorylated catalytic subunit of MAPK (active), there is an apparent decrease in the phosphorylation level in the early phase (30 minutes) and increase in the late stage (120 minutes) of the amastigogenesis process. As for the general protein phosphorylation profile, there is a decrease in phosphorylation around 30 minutes, followed by an increase in phosphorylation of proteins (approximately 5 and 100 kDa), but overall, no major changes were observed in this profile with the methodology used. As for modifications by NO and its derivatives, modifications were observed by S-nitrosylation and protein nitration, besides the increase of cGMP around 60 minutes. Although these modifications modulate the biological activity of a wide range of proteins, their biological role has not been explored. In summary, our results point to a variation in phosphorylation, S-nitrosylation and nitration profile of proteins, as well as an increase in cAMP and cGMP along the amastigogenesis process, implicating kinases / phosphatases and nitric oxide dependent signaling pathways in this differentiation

Role of protein kinase G on the post-shock mesenteric lymph blockage ameliorating vascular calcium sensitivity

PURPOSE: To investigate the role of protein kinase G (PKG) in blocking post-shock mesenteric lymph (PSML) return ameliorating the calcium sensitivity in hemorrhagic shock rats. METHODS: Male Wistar rats were randomly divided into sham, shock, shock+ligation (shock plus mesenteric lymph duct ligation (MLDL)), shock+drainage (shock plus PSML drainage) groups. After shock (hypotension 40mmHg) for three hours or corresponding times, the superior mesenteric artery (SMA) was taken out for detecting the PKG and phospho PKG (p-PKG) contents, and the vascular rings of SMA were prepared for assaying the calcium sensitivity using an isolated organ perfusion system. RESULTS: The PKG and p-PKG contents of SMA in shock group were significantly increased than that of sham group, and MLDL or PSML drainage reducing the levels of PKG and p-PKG. Meanwhile, the vascular calcium sensitivity in shock group was significantly lower than that of sham group, MLDL or PSML drainage enhanced the calcium sensitivity. After incubating with PKG regulators in shock+ligation and shock+drainage groups, the PKG agonist 8Br-cGMP reduced the contractility of vascular rings to gradient calcium ions and Emax and the PKG inhibitor agonist KT5823 elevated the calcium sensitivity significantly. CONCLUSION: Protein kinase G plays an important role in post-shock mesenteric lymph blockage improving vascular calcium sensitivity.