Caracterización de línea celular de paratiroides humana (RCPTH) y evaluación de tumorigenicidad en ratones NOD/SCID / Characterization of human parathyroid cell line (RCPTH) and tumorigenicity evaluation in NOD/SCID

Background: Cell therapy could be an alternative for the treatment of hypoparathyroidism. Therefore efforts have been made to establish a cell line of parathyroid cells. Aim: To establish a continuous functional and non-tumorigenic human parathyroid cell line. Material and Methods: Nineteen tissue samples from 15 patients subjected to parathyroidectomy due to primary or secondary hyperparathyroidism were obtained. Functional, morphological and tumorigenic properties of the obtained cells were analyzed. Results: After two months of culture in conditions of immortalization, cells had an exponential growth without experiencing senescence. Therefore, more than 200 sub cultures have been performed. The cell line was denominated RCPTH. Morphological characterization showed monolayer growth with contact inhibition and a duplication time of 30 hours. On light microscopy, pleomorphism and low number of mitoses were observed. Cells accumulated glycogen, expressed calcium sensing receptor and had positive PTH cytoplasmic clusters. The line secreted PTH initially but subsequently, PTH production became undetectable. The cell line did not have tumor or metastatic growth. Conclusions: A parathyroid cell line has been established. The lack of PTH production is a problem that will require the search for mechanisms to activate it.

Detección inmunohistoquímica de parafibromina en patología de paratiroides / Immunohistochemical detection of parafibromin in parathyroid pathology

Introduction: The definitive diagnosis of parathyroid cancer is extremely difficult, from the clinical approach to the molecular diagnosis. A gene mutation was detected recently in patients with parathyroid cancer. It is a suppressor tumor gene called HRPT2, which codifies for a protein that participates in PAF1 complex, the parafibromin. It has been observed that the expression of this protein it's altered in parathyroid cancer, what would serve like method of diagnosis by immunohystochemistry, with a sensitivity and specificity of 73-96 percent and 99-100 percent respectively. Material and Method: The anti-parafibromin immunohysto-chemistry staining was made in 23 parathyroids tissue samples (5 adenomas, 6 hyperplasia, 7 normal and 5 carcinomas). Results: A positive pattern is observed in almost 100 percent of benign pathology and 100 percent in normal tissue. In the cases of carcinoma only 2 of 5 had a strong positivity. Conclusions: The pathological clinical correlation does not allow the association of the loss of parafibromin immunoreactivity in some unequivocal cases of parathyroid cancer. The parafibromin immunostaining does not allow to discriminate between benign or malign pathologies.

Introducción: El diagnóstico definitivo de cáncer de paratiroides es extremadamente difícil, desde el acercamiento clínico hasta el diagnóstico molecular. Se detectó recientemente en pacientes con cáncer de paratirodes un gen supresor de tumor mutado (HRPT2), que codifica para una proteína que participa en el complejo PAF1, la parafibromina. Se ha observado que la expresión de esta proteína está alterada en los casos de cáncer de paratiroides, lo que serviría como método de diagnóstico por inmunohistoquímica, con una sensibilidad y especificidad de 73-96 por ciento y 99-100 por ciento, respectivamente. Material y Método: Se realizó tinción inmunohistoquímica anti parafibromina en 23 muestras de tejido paratiroideo (5 adenomas, 6 hiper-plasias, 7 normales y 5 carcinomas). Resultados: Se observa un patrón positivo fuerte en casi 100 por ciento de la patología benigna y 100 por ciento en tejido normal. En los casos de carcinoma sólo 2 de 5 tenían positividad fuerte. Conclusiones: La correlación clínico patológica no permite asociar la pérdida de tinción de parafibromina en algunos casos de cáncer inequívocos. La tinción de parafibromina no permite discriminar entre patología benigna y maligna.

Microencapsulación de células y tejido para terapia celular / Cellular and tissue microencapsulation for cellular therapy

Microencapsulation is a technique that protects viable cells in semi-permeable membranes, which allow passage of essential molecules while stopping larger molecules, such as antibodies, involved in the death of transplanted cells. This allows the avoidance of immunosuppressive drugs. Several substances have been used for this purpose, and alginate is one of the most studied and validated. Alginate is extracted from algae present in African and Chilean coasts; different algae can be mixed in variable proportions to produce alginate with distinct characteristics. Commercial alginate evokes an inflammatory response that results in the death of transplanted cells. High purity alginate has already been developed to avoid this issue. There are several applications to this technique, as there are a large number of pathologies that result from the destruction or extraction of tissues, with the consequent loss of function (diabetes mellitus or post-surgical hypoparathyroidism, for example). Finally, there is an additional interest in alginate microencapsulation in this country, given that it can be easily obtained from national algae.

La microencapsulación es una técnica que protege células viables en membranas semi-permeables, que permite el paso de moléculas que son esenciales para la célula y a la vez impide el paso de otras, como los anticuerpos, involucradas en la destrucción celular. Esto permite evitar el uso de drogas inmunosupresoras. Variadas biomacromoléculas pueden ser utilizadas con este fin, siendo el alginato uno de los biopolímeros más validados y estudiados. El alginato es un polisacárido amónico formado por unidades acidas b-L-manurónicas y a-L-gulorónicas, extraído desde algas presentes en costas africanas y chilenas. Así, diferentes algas pueden ser mezcladas en proporciones variables para producir alginatos de distintas características. El alginato comercial produce una respuesta inflamatoria que causa la muerte de las células trasplantadas; ya se han desarrollado alginatos de alta pureza para evitar este problema. Existen varias aplicaciones para esta técnica, ya que existen diversas patologías caracterizadas por una pérdida de función por destrucción o extracción de tejido (por ejemplo, diabetes mellitus o hipoparatiroidismo post-quirúrgico). Esta técnica representa un especial interés en Chile, ya que el alginato puede ser obtenido fácilmente a partir de algas chilenas.

Optimización de cultivos de hepatocitos humanos para estudios de citotoxicidad / Optimization of human hepatocyte cultures for citotoxicity studies

Los cultivos de hepatocitos entregan un valioso acercamiento al estudio de las funciones metabólicas específicas del hígado, evaluación de citotoxicidad. No existen líneas humanas inmortales con función normal. La inmortalización de hepatocitos humanos con el método UCHT1(medio de cultivo condicionado por células tumorales de tiroides) permitirá prolongar la sobrevida y función de estos, siendo útil para evaluar funcionalidad y citotoxicidad. Objetivo: Optimizar el cultivo de hepatocitos humanos. Metodología: En cultivos primarios de hepatocitos humanos, se agregó medio UCHT1 cultivando en superficies de colágeno, polilisina, gelatina y matrigel. Como control positivo, se utilizó línea Gherschenson (GER) para evaluar curva de crecimiento y producción de Glucógeno (PAS). Se evaluó citotoxicidad (LIVE/DEAD) en hepatocitos GER expuestos a Metotrexato (10, 100 y 1000 mM) a 24, 48 y 72 hrs. Resultados: Se realizó 3 cultivos primarios. Fue efectiva la utilización de Polilisina y Colágeno. Duración 8 meses. No se ha realizado la curva de crecimiento, ni evaluación de funcionalidad en hepatocitos humanos. La línea GER tiene un crecimiento exponencial (tiempo duplicación: 36 hrs). Se observó producción de glucógeno en condiciones de diferenciación hasta 120 hrs. La citotoxicidad por Metotrexato tiene una curva dosis dependiente, significativa en todas las concentraciones (p<0,001) (CL50 a 1000 mM a 24 hrs). Conclusiones: Se logró establecer una línea primaria de hepatocitos humanos. La polilisina y el colágeno han optimizado el establecimiento de cultivos primarios. El método PAS permitió evaluar producción de glucógeno (diferenciación). Los valores de citotoxicidad demostraron un efecto dosis dependiente en las condiciones experimentales. Logrando estandarizar el método para evaluación futura de líneas celulares humanas.

Background: Hepatocyte cultures are a valuable tool to study specific metabolic liver functions and cytoxicity. Human hepatocyte cell lines with normal function do not exist. Immortalization of human hepatocytes with a rat thyroid cell line (UCHT1) allows long-term survival and function of these cells, becoming useful to evaluate functionality and cytotoxicity. Aim: To optimize long-term culture of human hepatocytes. Material and Methods: UCHT1 media was added to primary cultures of human hepatocytes, seeding in collagen, gelatin, matrigel and polilisine surfaces. Gherschenson cell line (GER) was used as a positive control to evaluate the growth curve and Glycogen production (PAS). Cytotoxicity was evaluated (LIVE/ DEAD) in GER hepatocytes exposed to Metotrexate (10, 100 and 1000 µM) 24, 48 and 72 hrs. Results: Three primary cultures were made. The use of Polilisine and Collagen was effective. Cultures were kept for 8 months. Growth curves or evaluation of functionality in human hepatocytes, were not carried out. GER cell line had an exponential growth (duplication time: 36 hrs). Production of glycogen in differentiation conditions was observed up to 120 hrs. Cytotoxicity by Metotrexate had a dose dependent curve with a 50% lethal dose calculated as 1000 µM at 24 hrs. Conclusions: A primary line of human hepatocytes was obtained. Polilisine and collagen optimized the establishment of primary cultures. PAS method allowed the evaluation of glycogen production (differentiation). Cytotoxicity demonstrated a dose dependent effect in experimental conditions.

Cultivo primario e inmortalización de células de paratiroides para trasplante celular, en hipoparatiroidismo quirúrgico / Primary culture and immortalization of parathyroid cells for cell transplantation, in surgical hypoparathyroidism

El hipoparatiroidismo permanente ocurre después de tireidectomía (0,2-4 por ciento) o de cirugía paratiroidea. Lamentablemente el autotransplante no es 100 por ciento efectivo para prevención, y los pacientes deben recibir suplementación de vitamina D y calcio de por vida, con un costoso y a veces difícil manejo médico. Poca experiencia hay a nivel mundial de alotrasplantes paratiroideos en humanos. Un grupo de investigadores logró un período de sobrevida del injerto de 1 año en 8 pacientes, pero sin consignar los requerimientos de calcio y vitamina D. La dificultad de esta terapia es el rechazo por aloinmunización, y el establecimiento de cultivos primarios duraderos que permita conseguir una masa de células suficiente para el trasplante. Se ha logrado mantener cultivos, y función endocrina de ellos, por 60 días máximo. Nuestro objetivo es modificar y optimizar los cultivos primarios de paratiroides humana para: a)Obtener una línea continua de células paratiroideas, b)caracterizar la línea en cuanto a función endocrina, y c)disminuir la antigenicidad, como fuente futura de trasplante celular. La serie presentada incluye 5 pacientes intervenidas quirúrgicamente por hiperparatiroidismo primario, con diagnóstico definitivo de adenoma paratiroideo. Las muestras fueron sometidas a digestión enzimática y disgregación mecánica, cultivándose finalmente en placas de Petri a 37 °C. Resultados: Todos los cultivos primario fueron efectivos, con morfología típica a la microscopia. El primer cultivo creció y produjo PTH, pero no sobrevivió a contaminación del medio de cultivo. Los otros 4 están aún en período de expansión (crecimiento y multiplicación) con 150,60,40 y 35 días de cultivo. La función endocrina de las células en cultivo fue estudiada midiendo PTH en el medio de cultivo. Se obtuvo una producción promedio de 521,6 pg/ml en 24 horas (224-730 pg/ml). Todos los cultivos fueron positivos para esta medición.