Résumé
Although different DNA polymerases have distinct functions and substrate affinities, their general mechanism of action is similar. Thus, they can all be studied using the same technical principle, the primer extension assay employing radioactive tags. Even though fluorescence has been used routinely for many years for DNA sequencing, it has not been used in the in vitro primer extension assay. The use of fluorescence labels has obvious advantages over radioactivity, including safety, speed and ease of manipulation. In the present study, we demonstrated the potential of non-radioactive in vitro primer extension for DNA polymerase studies. By using an M13 tag in the substrate, we can use the same fluorescent M13 primer to study different substrate sequences. This technique allows quantification of the DNA polymerase activity of the Klenow fragment using different templates and under different conditions with similar sensitivity to the radioactive assay.
Sujets)
Analyse de séquence d'ADN , DNA polymerase I/métabolisme , Escherichia coli/enzymologie , Fluorescéine/métabolisme , Amorces ADN/métabolisme , Automatisation , Concentration en ions d'hydrogèneRésumé
Se caracterizó la presencia de receptores (R)ß adrenérgicos em linfocitos murinos normales estimulados com Concanavalina A (Con A) y en una línea celular hiperproliferativa (BW5147) mediante la unión específica del radioligando 125Iodo-cianopindolol (125I/CYP)) a las células. La funcionalidad de los R se midió a través de cambios en la produccón de AMPc en presencia del agonista ß adrenérgico isoproterenol (ISO). Ambos tipos celulares mostraron un número disminuido de R ß adrenérgicos por unión específica al 125I-CYP. Se midieron los niveles intracelulares de AMPc en presencia de un agonista ß adrenérgico, las células BW5147 no mostraron un incremento significativo en los niveles de AMPc mientras que las células con Con A mostraron un incremento aunque menor al que presentan linfocitos normales, sin embargo, ambos tipos celulares respondieron a la prostaglandina E1(PGE1) produciendo un incremento en la produción de AMPc. Podemos concluir que la línea celular hiperproliferativa BW5147 no posee R funcionales, en este trabajo se analiza la posible implicancia de un camino intracelular alternativo y su control neuroendocrino