Caracterização e detecção molecular de alelos de resistência ao biolarvicida Bacillus sphaericus em culex quinquefasciatus / Characterization and molecular detection of resistance alleles to the Bacillus sphaericus biolarvicide in Culex quinquefasciatus

A resistência de Culex quinquefasciatus à toxina inseticida (Bin) de Bacillus sphaericus (Bsp) pode estar associada a uma falha da ligação da toxina com os receptores Cqm1, localizados no microvilli intestinal das larvas através de uma âncora GPI. Mutações no gene cqm1 podem impedir a expressão de proteínas Cqm1 funcionais e gerar um alto nível de resistência. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a frequência de alelos de resistência (r) em populações e colônias de C. quinquefasciatus. Neste estudo, o alelo r cqm1REC, selecionado e identificado anteriormente na colônia R2362, foi detectado por PCR alelo-específica em quatro populações de Recife com frequências entre 0,001 e 0,017. Em duas populações foram identificados novos alelos r, o cqm1REC-D16 e o cqm1REC- D25, com frequência entre 0,002-0,006. Estes alelos são caracterizados por deleções de 16 e 25-nt, respectivamente, as quais geram códon de terminação da tradução prematuro (CTTP) e não codificam proteínas com âncora GPI. Um segundo alelo r (cqm1REC- 2) foi identificado na colônia R2362 e possui uma mutação nonsense (G1292A) que também gera um CTTP, impedindo a localização de receptores Cqm1 no epitélio. O alelo cqm1REC-2 foi co-selecionado com o cqm1REC na colônia R2362 e uma análise da competição entre eles mostrou que o cqm1REC-2 predomina sob pressão de seleção com Bsp, enquanto que o cqm1REC é majoritário na ausência de Bsp. A expressão relativa dos alelos cqm1REC e cqm1REC-2, avaliada por PCR em tempo real, mostrou que ambos possuem uma expressão significativamente menor em relação ao cqm1. Amostras de microvilli intestinal de larvas homozigotas para cada alelo apresentaram uma baixa capacidade de interação com a toxina Bin, corroborando os dados de expressão gênica e o fenótipo de resistência. Este estudo mostrou a detecção e caracterização de novos alelos de C. quinquefasciatus que conferem resistência a Bsp e estes dados são fundamentais para o diagnóstico e manejo da resistência em programas de controle.

Diagnóstico da resistência do vetor Culex quinqufasciatus ao biolarvicida Bacillus sphaericus / Resistance diagnostic of the vector Culex quinquefasciatus to the bioinsecticide Bacillus sphaericus

A eficácia e seletividade do Bacillus sphaericus (Bsp) para larvas do vetor Culex quinquefasciatus é devida à ligação específica da toxina binária (Bin), principal proteína inseticida do Bsp, a um receptor presente no epitélio intestinal das larvas, a glicosidase Cqm1. Um mecanismo de resistência descrito para este culicídeo é devido a uma deleção de 19 nucleotídeos (d19) no gene cqm1 (cqm1-d19) que, em homozigose, impede a expressão do receptor no epitélio. O objetivo deste trabalho foi determinar a freqüência do alelo cqm1-d19 em populações naturais de Cx. quinquefasciatus, não tratadas e tratadas com o Bsp, além de avaliar polimorfismos no gene cqm1. Uma análise in vivo da susceptibilidade ao Bsp em larvas de Cx. quinquefasciatus mostrou que as populações não tratadas de Varadouro, Peixinhos e Fazenda Nova apresentaram valores de razão de resistência (RR) de 1,3 a 4,0 vezes, enquanto que para a população tratada de Água Fria a RR variou de 2,7 a 8,6 vezes, em relação à população susceptível usada como controle. Os valores de RR inferiores a 10 indicaram que não houve alteração significativa na susceptibilidade. Os alelos cqm1 e cqm1- d19 foram identificados através de método diagnóstico de PCR utilizando primers que flanqueiam a d19 e as amostras das populações analisadas variaram entre 162 e 353 larvas. O alelo cqm1-d19 foi detectado pela primeira vez em populações naturais e sua freqüência em áreas não tratadas da Região Metropolitana do Recife (RMR) foi de 1,16 x 10-2 em Varadouro e de 7,8 x 10-3 em Peixinhos. Na população de Fazenda Nova, isolada geograficamente da RMR, o alelo não foi detectado. Em Água Fria, tratada com o Bsp desde 2003, as freqüências foram bem mais elevadas em relação às populações não tratadas: 6,94 e 5,55 x 10-2 após 13 e 24 tratamentos, respectivamente. Em paralelo à detecção do alelo foi feita a avaliação da freqüência de expressão da -glicosidase Cqm1, através de ensaios enzimáticos in gel, e os resultados corroboraram aqueles de freqüência alélica em todas as populações. A partir da análise de polimorfismos no gene cqm1 em 15 indivíduos de Água Fria, foram identificados 13 alelos, baseados em 13 alterações na seqüência de aminoácidos, a maioria na região C terminal. Dentre os alelos identificados, dois ocorreram em maior freqüência e os demais foram variações destes principais. Os resultados deste estudo mostraram que a freqüência do alelo cqm1-d19 é alta em populações naturais, e mais elevada naquelas que estão sob pressão de seleção, além de demonstrarem que o gene cqm1 é altamente polimórfico. As abordagens moleculares utilizadas neste estudo são mais sensíveis que os bioensaios, visto que foi possível detectar indivíduos heterozigotos e homozigotos resistentes, e são adequadas para avaliar a susceptibilidade de populações de Cx. quinquefasciatus ao Bsp. Estes dados reforçam a adoção de medidas visando o uso sustentável do biolarvicida Bsp em programas de controle de vetores.