APPLICABILITY OF kDNA-PCR FOR ROUTINE DIAGNOSIS OF AMERICAN TEGUMENTARY LEISHMANIASIS IN A TERTIARY REFERENCE HOSPITAL / Aplicacao do kDNA-PCR para diagnostico de rotina de leishmaniose tegumentar americana em um hospital de referencia

SUMMARY This study evaluated the applicability of kDNA-PCR as a prospective routine diagnosis method for American tegumentary leishmaniasis (ATL) in patients from the Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), a reference center for infectious diseases in São Paulo - SP, Brazil. The kDNA-PCR method detected Leishmania DNA in 87.5% (112/128) of the clinically suspected ATL patients, while the traditional methods demonstrated the following percentages of positivity: 62.8% (49/78) for the Montenegro skin test, 61.8% (47/76) for direct investigation, and 19.3% (22/114) for in vitro culture. The molecular method was able to confirm the disease in samples considered negative or inconclusive by traditional laboratory methods, contributing to the final clinical diagnosis and therapy of ATL in this hospital. Thus, we strongly recommend the inclusion of kDNA-PCR amplification as an alternative diagnostic method for ATL, suggesting a new algorithm routine to be followed to help the diagnosis and treatment of ATL in IIER. .

RESUMO Este estudo avaliou a aplicabilidade do kDNA-PCR como método de rotina para diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana (ATL) no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), São Paulo, SP, Brasil. O método kDNA-PCR detectou DNA de Leishmania em 87,5% (112/128) dos pacientes com suspeita de ter leishmaniose e, os métodos tradicionais apresentaram as seguintes porcentagens de positividade: 62,8% (49/78) para o teste de Montenegro, 61,8% (47/76) para a pesquisa direta e 19,3% (22/114) para cultura in vitro. O método molecular confirmou a doença em amostras negativas ou inconclusivas pelos métodos laboratoriais tradicionais e, mostrou-se capaz de auxiliar na identificação de infecções causadas pela espécie Leishmania (V.) braziliensis. Além disso, a revisão dos prontuários médicos confirmou a importância do método PCR-RFLP no diagnóstico final de ATL, prognóstico e escolha do tratamento. Assim, recomendamos a inclusão do PCR como método diagnóstico de ATL na rotina hospitalar, e sugerimos um fluxograma para solicitação de exames laboratoriais. .

Mapping of a Leishmania major gene/locus that confers pentamidine resistance by deletion and insertion of transposable element

A Pentamidina (PEN) é um composto alternativo para o tratamento de pacientes com leishmaniose que apresentam resistência ao antimônio, cujo alvo celular continua incerto. Uma abordagem para se identificar prováveis alvos seria a identificação e super-expressão de genes capazes de mediar resistência a PEN. A partir de uma genoteca construída com o DNA de Leishmania major em um vetor - cosmídio que se desenvolve tanto em bactérias como nas células do parasita, isolamos um locus que após transfecção é capaz de produzir resistência a PEN às células do parasita. Almejando o mapeamento desse locus de leishmania, o inserto clonado nesse cosmídio foi deletado através de duas digestões parciais sucessivas com enzimas de restrição, seguida de transfecção em células selvagens, super-expressão gênica, indução e testes funcionais na presença de PEN. Para determinar o gene de Leishmania relacionado com a resistência a PEN, o seqüenciamento de nucleotídeos foi executado após inserção de elementos transposicionais de Drosophila melanogaster no interior do inserto deletado para atuar como ilhas de iniciadores. Descrevemos aqui o mapeamento desse locus, após a inserção transposicional, que além de facilitar o seqüenciamento de nucleotídeos de grandes fragmentos de DNA, permite uma rápida identificação do gene relacionado com esse fenótipo. Experimentos posteriores revelaram neste locus a presença do gene de uma Glicoproteína-P de membrana, cujo papel no metabolismo na Leishmania está sendo analisado.