Résumé
Una alta expresión de tPA humana recombinante en células de hamster chino (CHO), fue obtenida usando el sistema de coamplificación del gen de la dehidrofolato reductasa (DHFR). La proteina fue secretada activa al medio de cultivo. En varios clones se mantuvo la producción estable, aun en ausencia de presión selectiva. No obstante, cuando el mismo ADN complementario fue clonado en un vector de expresión de baculovirus, sólo fue posible detectar niveles muy bajos de actividad tPA
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Cricetinae , Animaux , Clones cellulaires , Cricetulus , ADN , Amplification de gène , Ovaire , Plasminogène , Dihydrofolate reductase , CubaRésumé
Se obtuvieron ratones transgénicos que incorporaron a su genoma la construcción híbrida conformado por el gen de la hormona del crecimiento humana bajo el control del promotor de la metalotioneina-I de ratón. Una alta eficiencia en la generación de los ratones transgénicos (45 %) fue alcanzada. Tanto los transgénicos fundadores (FO) como una línea de primera generación (F1) obtenida, expresan en el suero la hormona de crecimiento humana y presentan un notable incremento de peso corporal (hasta 2,03 veces)en comparación con sus hermanos no transgénicos
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Banque génomique , Hormone de croissance , Souris transgéniquesRésumé
La microinyección pronuclear de ADN en embriones unicelulares se ha empleado para la generación de bovinos transgénicos (Roschlau et al 1988, Purcel et al, 1989). Recientemente se reportó que los espermatozoides maduros son capaces de capturar moléculas de ADN en suspensión y se obtuvieron ratones transgénico utilizando las cálulas espermáticas como vectores (Lavitran et al, 1989). Nosotros demostramos que esoermatozoides maduros de varias especies animales, incluido bovinos, son capaces de asociar moléculas en suspensión (Castro et al. 1990). En este trabajo reportamos la encubación de moléculas de ADN con espermatozoides bovinos y su empleo en la Inseminación artificial de tres vacas superovuladas. Los blastocitos fueron recuperados 11 dias después de la Inseminación y se extrajo el ADN de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En dos animales se encontraron blastoscistos transgénicos portadores del ADN foráneo. Esto permite considerar los espermatozoides como un posible vehículo para transferencia de ADN en bovinos
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Bovins , Animaux , Bovins , Biosynthèse des protéines , SpermatozoïdesRésumé
En el presente trabajo se reporta la síntesis total del gen que codifica para la eritropoyetina humana, hormona glicoproteica de 166 aminoácidos, que constituye la hormona principal para la regulación y el mantenimiento, a niveles fisiològicos, de la masa de eritrocitos circulantes el la sangre. El diseño del gen sitético 620 pb, incluye la secuencia que codifica para el péptido señal de 27 aminoácidos, la secuencia consenso CCACC,los sitios de restricción Bgl LL y EcoR l en los extremos 5' y 3' y los codones más frecuentes en eucariotas. Fueron sintetizados en fase sólida, por el método del ß-cianoetilfosforamidito, 54 oligonuleótidos. El gen sintetizado, uno d4 los mayores reportados sin el uso de subclonajes de fragmentos, fue insertado en un vector de expresión para células de mamíferos y secuenciado con el método Sanger
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Humains , Érythropoïétine , Gènes de synthèseRésumé
Células de melanoma de Bowes fueron encapsuladas en perlas de alginato de calcio y cultivadas en frascos de rotación y en un reactor de cama fluidizada. En las partículas de gel se alcanzaron concentraciones celulares mayores. Se estudió la producción del activados tisular del plasminógeno (t-PA). Utilizando el reactor de cama fluidizada se logró un efectivo recambio de medio de cultivo y se alzanzó una mayor productividad de t-PA/célula/dia (0,2 pg/célula/dia). El método de inmovilización de células en perlas de alginato de calcio fue efectivo para la producción en continuo de t-PA en células de melanoma de Bowes dependientes de anclaje
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Alginates , Milieux de culture , Mélanome , Activateurs du plasminogèneRésumé
Recientemente nosotros expresamos el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en células CHO utilizando el sistema de amplificación DHFR/metotrexate (Pérez et al, 1988). En este trabajo reportamos el estudio de las secuencias integradas en el genoma celular producto de la transfección y su evolución durante el proceso de amplificación. Los resultados obtenidos indican que en los clones analizados, la información transfectada posee rearreglos originados durante el proceso de amplificación y que el amplicón contiene fragmentos génicos del hospedero. Se concluye también que el ADN plasmídico integrado en el genoma celular posee frecuentes deleciones. SE discute un modelo del amplicón
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Cricetinae , Souris , Animaux , Chromosomes , Amplification de gène , Antigènes de surface du virus de l'hépatite B , Dihydrofolate reductaseRésumé
La inmovilización de células animales se ha logrado empleando diferentes vías, se ha utilizado para alcanzar cultivos de alta densidad y como una alternativa a la terapia génica de células somáticas. En este trabajo se reporta una metodología para la encapsulación de células de melanoma de Bowes y células CHO productoras de ht-PSA recombinante en perlas de alginato de calcio. Las células de melanoma de Bowes encapsuladas se emplearon para la producción de ht-PA en un reactor de cama fluidizada. Las células CHO productoras de ht-PA recombinante y encapsuladas, se inocularon en ratones y se demostró la presencia de anticuerpos específicos anti-ht-PA en estos animales
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Souris , Animaux , Alginates , Calcium , CellulesRésumé
Para determinar la actividad estreptoquinasa (SK) presente en muestras de cultivo y purificación, se desarrolló un método cuantitativo a partir de la formación del complejo estequiométrico estreptoquinasa-plasminógeno (sk-plg). Las determinaciones fueron realizadas utilizando el método del sustrato cromogénico S-2251. La sk se obtuvo del cultivo de Streptococcus equisimilis beta hemolítico (grupo C). El plasminógeno empleado en el ensayo fue purificado a partir de plasma humano en nuestro laboratorio. El método permite la detección de hasta 7 UI de sk/ml. En el trabajo se describen los resultados obtenidos a diferentes concentraciones de sales presentes en las muestras, así como el efecto estimulador del fibrinógeno en la reacción
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Fibrinogène , Plasminogène , StreptokinaseRésumé
El sistema de restrición-metilación (RMSII) Pvull de P. vulgaris fue clonado y expresado con altos niveles en E. coli. Se estudió el efecto de la alta expresión de restrictasa y metilasa en diferentes cepas de E, coli, resultando la cepa HB101 (mrcB) la única eficientemente transformable con plasmidios portadores de RMSII Pvull. Se aplicó un nuevo procedimiento para la purificación de la restrictasa Pvull recombinante utilizando cromatografía de intercambio iónico. Los métodos empleados permitieron la obtención de grandes cantidades de restrictasa Pvull, libre de exonucleasas y endonucleasas inespecíficas
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Clonage moléculaire , DNA restriction enzymes/isolement et purification , Expression des gènes , Proteus vulgarisRésumé
La introducción de ADN foráneo en los primeros estadíos de desarrollo embrionario del ratón con vistas a obtener animales transgénicos, permite crear nuevos modelos animales para el estudio de enfermedades humanas. Con la finalidad de crear un modelo de portador sano del virus de la hepatitis B (VHB), fueron microinyectados embriones unicelulares murinos con un plasmidio recombinante que contenía el genoma completo del VHB excepto el gen codificante para las proteínas del core viral, bajo el control del promotor propio del VHB. Se obtuvieron ratones transgénicos que presentaban integración y expresión del material génico viral. La expresión del gen del antígeno de superficie del VHB (HBsAg) fue cuantificada y se confirmó la segregación del transgen a la generación filial F1. Se concluye que estos ratones transgénicos pueden representar un modelo de portador asintomático de la hepatitis B.
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Souris , Animaux , Antigènes de surface du virus de l'hépatite B/génétique , Expression des gènes , Souris transgéniquesRésumé
Se construyó una genoteca bovina en el bacteriófago 2EMBL3por el método de llenado parcial de los extremos cohesivos. Se estudian los efectos de los sistemas de restricción de E. coli en la amplificación de la biblioteca y se demuestra que el sistema McrB en las cepas derivadas del E. coli K-12, interfiere en la propagación de los fagos recombinantes durante la amplificación de la genoteca. El empleo de la cepa E. coli C-1a en la construcción de genotecas de eucariotes superiores conjuntamente con el método anterior permite obtener genotecas de alta eficiencia y representatividad
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Bovins , Animaux , Bovins , Escherichia coli , Amplification de gène , Banque génomiqueRésumé
La infección por el virus de la hepatitis B (HBV), es uno de los problemas más serios de la humanidad. La utilización de células de mamíferos en cultivo para la producción de una vacuna contra el HBV, ofrece un conjunto de ventajas en comparación con otros sistemas celulares. Nosotros hemos producido el antígeno de superficie de la hepatitis tipo B (HBsAg) recombinante, en células CHO utilizando el sistema de amplificación DHFR/mtx. Se obtuvo una producción de 1 * HBsAg/10 a la 6 células/día, y el HBsAg recombinante fue caracterizado por microscopía electrónica y resultó similar a las partícyulas de HBsAg derivadas de plasma
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Cricetinae , Animaux , Antigènes de surface du virus de l'hépatite B/isolement et purification , Cellules cultivées , Vaccins contre les hépatites viralesRésumé
El gen del interferón *-2(IFN *-2) humano fue expresado en la levadura S. cerevisiae. Se logra la secreción de esta proteína empleando el péptido señal del factor * de tipo de apareamiento, bajo el control de la secuencia promotora del propio factor * de tipo de apareamiento, y también del fragmento corto del promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa. Los niveles de expresión logrados con estas construcciones son del orden de 10 a la cinco y 10 a la seis UIF/ml
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Expression des gènes , Interféron de type I/métabolisme , Saccharomyces cerevisiaeRésumé
En el presente trabajo se describe una forma novedosa para la expresión directa de proteinas maduras de mamíferos en E.coli. Las regiones 3' y 5' no taducidas, y la secuencia señal de la hormona de crecimiento humana (hGH) fueron removidas, y un codón de iniciación se situó adyacente al primer codón de la secuencia correspondiente a la proteína madura. Los sitios de restricción Ncol Y BamHI fueron introducidos en las regiones 5' y 3' respectivamente, y la secuencia correspondiente a la proteína madura se amplificó por el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonándose directamente en un vector de expresión. Se alcanzaron altos niveles de expresión en E. coli
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Clonage moléculaire , Escherichia coli , Hormone de croissanceRésumé
El gen del interferón *-2 humano (IFN-2) fue expresado en E. coli bajo el control del promotor derecho del bacteriófago Lambda (PR). La expresión de la actividad de IFN-2 en células que contenían este plásmido fue termoinducible. Se lograron niveles de expresión de hasta 5 x 108 UI/I