Variantes genéticas frecuentes del factor von Willebrand: su influencia en el laboratorio y la clínica / Frequent genetic variants of von Willebrand factor: its influence in the laboratory and clinic

El factor von Willebrand (VWF) es una glucoproteína altamente polimórfica. Se describen aquí diferentes variantes genéticas asintomáticas altamente frecuentes, sus influencias sobre los estudios fenotípicos, en los niveles plasmáticos del mismo, y por consiguiente en diferentes entidades clínicas. Se detallan también variaciones en la frecuencia alélica según las etnias analizadas. El objetivo de este trabajo fue alertar sobre la necesidad de conocer la frecuencia de los polimorfismos en la población normal para evitar posibles conclusiones erróneas al momento del hallazgo de cambios no previamente reportados en la literatura científica.

The von Willebrand factor (VWF) is a highly polymorphic glycoprotein. Several frequent asymptomatic genetic variants, their influences on phenotypic studies, on the plasma levels of VWF, and therefore in different clinical entities are described here. Variations in allele frequency in different ethnic groups analyzed are also detailed. The aim of this study was to highlight the need to know the frequency of polymorphisms in the normal population to avoid possible erroneous conclusions at the time of finding genetic variants not previously reported in the scientific literature.

O fator von Willebrand (VWF) é uma glicoproteína altamente polimórfica. Diversas variantes genéticas assintomáticas muito frequentes são descritas aqui, suas influências em estudos fenotípicos, nos níveis plasmáticos de VWF e, portanto, em diferentes entidades clínicas. Variações na frequência alélica também são detalhadas segundo diferentes grupos étnicos analisados. O objetivo desse trabalho é alertar sobre a necessidade de conhecer a frequência dos polimorfismos na população normal, a fim de evitar possíveis conclusões errôneas no momento de encontrar variações genéticas não relatadas anteriormente na literatura científica.

Factor von Willebrand y Enfermedad de von Willebrand: nuevos enfoques diagnósticos / Von Willebrand Factor and von Willebrand disease: new approaches to diagnosis / Fator Von Willebrand e doença de von Willebrand: novas abordagens diagnósticas

El factor von Willebrand (VWF) es una glicoproteína que se sintetiza en células endoteliales y en megacariocitos. Su vida media es de ~12 horas. Está formado por multímeros de diferentes pesos moleculares, pequeños, intermedios, grandes y extragrandes. La actividad funcional reside en los multímeros grandes, y los extragrandes son trombogénicos. Promueve la adhesión plaquetaria al subendotelio, la agregación plaquetaria y transporta al FVIII en plasma, protegiéndolo de su degradación por proteasas. La enfermedad de von Willebrand es el trastorno hemorrágico más frecuente; se describen deficiencias cuantitativas (parcial: VWD1; total: VWD3) o defectos cualitativos (VWD2A, VWD2M, VWD2B y VWD2N). La expresión clínica es variable (sangrado muco-cutáneo) y su herencia autosómica, dominante o recesiva, según las variantes. Los niveles del VWF dependen de factores genéticos y no genéticos que afectan el diagnóstico y la expresión clínica. Para llegar al diagnóstico se precisan varias pruebas, algunas inespecíficas. El laboratorio comienza con pruebas orientadoras, se continúa con pruebas confirmatorias, y posteriormente pruebas para definir la variante de VWD. El diagnóstico genotípico es fundamental para lograr el diagnóstico diferencial entre VWD2B vs. PT-VWD y VWD2N vs. Hemofilia A (leve-moderada), diferenciar VWD de AVWS y discriminar variantes VWD2.

Von Willebrand factor (VWF) is a glycoprotein with essential roles in both primary and secondary hemostasis, synthesized by endothelial cells and megakaryocytes. Its half-life is ~12 hours. VWF consists in multimers of different molecular weight: small, intermediate, large and ultra large. The functional activity resides in the large multimers; the ultra large are thrombogenic. VWF promotes platelet adhesion to subendothelium, platelet aggregation and binds FVIII, protecting it from proteolysis and preserving its hemostatic function. Von Willebrand disease is the most common bleeding disorder; qualitative defects (VWD2A, VWD2M, VWD2B and VWD2N) and quantitative deficiencies (VWD1 and VWD3) are described. The clinical expression is variable (mucocutaneous bleeding); VWF levels depend on genetic and non-genetic factors affecting diagnosis and clinical expression. The inheritance can be autosomal, dominant or recessive according to the variants. To reach diagnosis, several tests are required, being some of them unspecific. The laboratory testing begins with global tests, followed by confirmatory tests and further tests to define the variant of VWD. Genotypic studies are essential to achieve the differential diagnosis between VWD2B vs. PT-VWD, VWD2N vs. Hemophilia A (mild to moderate) and differentiate VWD from AVWS and discriminate VWD2 variants.

O fator de von Willebrand (vWF) é uma glicoproteína sintetizada em células endoteliais e em megacariócitos. Sua vida média é de ~12 horas. É constituído por multímeros de pesos moleculares diferentes, pequenos, intermediários, grandes e extragrandes. A atividade funcional reside nos multímeros grandes, sendo os extragrandes, trombogênicos. Promove adesão das plaquetas ao subendotélio, a agregação plaquetária e transporta o FVIII em plasma, protegendo-o de sua degradação. A doença de von Willebrand é o distúrbio hemorrágico mais frequente; são descritas deficiências quantitativas (parcial: VWD1; total: VWD3) ou defeitos qualitativos (VWD2A, VWD2M, VWD2B e VWD2N). A expressão clínica é variável, (sangramento mucocutâneo), e sua herança autossômica dominante ou recessiva de acordo com as variantes. Os níveis de vWF dependem de fatores genéticos e não-genéticos que afetam o diagnóstico e a expressão clínica. Para fazer o diagnóstico, vários testes são necessários, alguns inespecíficos. O laboratório começa com testes orientadores, continua com testes de confirmação e, mais tarde, com testes para definir a variante de VWD. O diagnóstico genotípico é essencial para alcançar o diagnóstico diferencial entre VWD2B vs. PT-VWD e VWD2N vs. Hemofilia A (leve a moderada), diferenciar VWD de AVWS, discriminar variantes VWD2.

Inhibidor lúpico en situaciones clínicas diferentes al síndrome antifosfolipídico / Lupus inhibitor in clinical situations other than antiphospholipid syndrome

El inhibidor lúpico (IL) es uno de los criterios de laboratorio para Síndrome Antifosfolipídico (SAF); sin embargo, puede detectarse en individuos asintomáticos o estar asociado a otras situaciones clínicas. Presentamos un análisis retrospectivo de 1000 exámenes consecutivos para IL (TTPA, DRVVT) de los cuales 249 casos no presentaban criterios clínicos de SAF. Aplicando los criterios SSC-ISTH, hallamos IL+ en 27,30% (205/751) y 43,37% (108/249) de los casos con y sin criterios clínicos de SAF respectivamente; analizándose en estos últimos casos las características clínicas y de laboratorio. Contexto clínico de casos IL+ sin SAF: 18,52% asintomáticos, 34,26% síntomas de sangrado y 47,22% otras manifestaciones. Otras alteraciones de laboratorio en casos IL+ sin SAF, con síntomas de sangrado: detectamos alteraciones plaquetarias, descenso de VWF:RCo y/o VWF:Ag, disminución de FVIII, FV, FVII, FXI o fibrinógeno e hiperfibrinolisis en el 54,05% de los casos. El análisis mostró detección de IL+ en un número importante de estudios (108/1000) sin criterios SAF. Los casos con IL+ y sangrado representan un desafío particular, al requerir evaluar otros posibles defectos subyacentes, que pudiesen justificar el comportamiento clínico. La detección e identificación de defectos combinados requiriere de un análisis minucioso, a fin de alcanzar un diagnóstico correcto, esencial para tomar decisiones terapéuticas adecuadas. (AU)

Despite lupus anticoagulant (LA) is one of the laboratory criteria for antiphospholipid syndrome (APS), it can be present in asymptomatic subjects or it can be associated with other clinical settings. We present a retrospective analysis of 1000 consecutive LA assays (APTT, DRVVT), 249 of them were performed in patients without clinical criteria for APS. According to ISTH criteria, positive LA was found in 27.30% (205/751) and 43.37% (108/249) of cases with or without APS criteria respectively; in the last group, the analysis of clinical background and laboratory characteristics was done. Clinical background of LA+ cases without APS: 18.52% asymptomatic, 34.26% bleeding symptoms and 47.22% other clinical settings. Other abnormal laboratory tests in LA+ cases without APS and bleeding symptoms: platelet dysfunction; low VWF:RCo and/or VWF:Ag; decrease of FVIII, FV, FVII, FXI or fibrinogen and hyperfibrinolysis were found in the 54.05% of the cases. The analysis showed positive LA in an important number of cases (108/1000) without criteria of APS. Those LA+ cases with bleeding symptoms represent a particular challenge because other possible underlying defects have to be analysed in order to explain the clinical behaviour. The detection and identifications of combined defects required a careful analysis in order to achieve accurate diagnosis, essential for therapeutic decisions. (AU)

Vitamina K epóxido reductada (VKORC1): polimorfismos y sensibilidad a los dicumarínicos / Vitamin K epoxide reductase (VKORC1): polimorphisms and sensitivity to coumarin

Introducción: Los antagonistas de la vitamina K, tienen como blanco el complejo vitamina K epóxido reductasa. Hay polimorfismos (SNPs) en el gen de la subunidad 1 (VKORC1), como 1173 C>T (rs9934438) (intrón 1) y -1639 G>A (rs9923231) (región 3'UTR), asociados con diferente sensibilidad a los dicumarínicos. Objetivo: confirmar la relación entre estos SNPs y la dosis media requerida para una correcta anticoagulación. Material y Método: Estudiamos 102 pacientes (15-87 años) bajo tratamiento anticoagulante oral crónico, principalmente acenocumarol. La genotipificación fue realizada usando RFLPs (amplificación del ADN por PCR, seguida por digestión con Msp I para -1639 G>A y Sty I para 1173 C>T); analizándose luego la dosis media en los portadores de los diferentes SNPs. La frecuencia alélica obtenida para 1173 C>T fue similar a la calculada para -1639 G>A, observándose que 1179 C>T y -1639 G>A se hallan en desequilibrio de unión. La dosis media fue más alta en los pacientes portadores hemocigotos del alelo 1173 CC o -1639 GG que en los no portadores. La dosis media fue menor en individuos mayores de 70 años, independientemente de su genotipo. Reultados: Estos confirman la relación entre los SNPs analizados y la dosis de dicumarínicos.

Vitamin K epoxide reductase complex is the target of Vitamin K antagonists. Polymorphism (SNPs) in the gene of subunit 1 (VKORC1), 1173 C>T (rs9934438) (intrón 1) y -1639 G>A (rs9923231) (3'UTR), are associated with different sensitivity to oral anticoagulants. Objectives: our aim was to comfirm the relationship between these SNPs and the mean dose required for anticoagulation. Material and methods: One hundred and two patients (15-87 years) on chronic oral anticoagulant therapy, mainly acenocoumarol, were tested. Genotyping was performed using RFLPs (DNA's PCR amplification, followed by digestion with Msp I to Sty I to 1173 C>T). The mean dose of anticoagulantin carriers of different SNPs was calculated. A similar allelic frequency was obtained for 1173 C>T and -1639 G>A with linkage desequilibrium between them. The mean dose was higher in patients homozygous for 1173 CC or -1639 GG alleles than in non carriers. In those individuals over the age of 70, regardless of genotype, a lower mean dose was observed. Results: The results confirm the relationship between SNPs and oral anticoagulants.

Hemorragias mayores asociadas a cirugía en pacientes con enfermedad de Von Willebrand leve / Major haemorrhages associated with surgery in patients with mild von Willebrand disease

Introducción: Los pacientes con enfermedad de von Willebrand frecuentemente sangran frente a desafíos hemostáticos. Objetivos: Nuestro propósito fue identificar marcadores predictivos de hemorragia mayor en cirugías en pacientes con las variantes tipo 1 y posible tipo 1 de la enfermedad. Material y Métodos: Se registraron las hemorragias mayores en cirugías anteriores al diagnóstico y los parámetros de laboratorio en 311 pacientes. Éstos se agruparon de acuerdo con la ausencia (grupo A) o presencia (grupo B) de hemorragia mayor en cirugías. Resultados: Presentaron hemorragia mayor el 26 por ciento de los pacientes y 17,5 por ciento de las cirugías. No hubo diferencias en el porcentaje de pacientes tipo 1 (32,6 por ciento) y posible tipo 1 (24,8 por ciento) que tuvieron hemorragia mayor. Tampoco se observaron diferencias en la prevalencia del grupo sanguíneo O, edad, género, historia familiar y niveles de FVIII y VW entre los grupos A y B. La hemorragia post exodoncia fue el antecedente clínico más frecuente (P<0,000; RR=2,11; IC 95 por ciento = 1,3-3,5) y podría definir riesgo de hemorragias mayores. El bleeding score y el número de sitios de sangrado no resultaron predictivos de hemorragias mayores. Las cesáreas (24,6 por ciento) y adenoamigdalectomías (22,3 por ciento) fueron las cirugías con mayor frecuencia de hemorragias mayores. Conclusión: Los pacientes con VWD tipo 1 y posible tipo 1 mostraron similar incidencia de hemorragia mayor en cirugías. Los niveles de FVIII y VWF, el tiempo de sangría, historia familiar y grupo sanguíneo no resultaron efectivos como marcadores predictivos de hemorragia mayor. Sin embargo, el antecedente de sangrado post exodoncia y el tipo de cirugía a llevar a cabo (cesáreas y adenoamigdalectomías) en pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 1 y posible tipo 1 parecen importantes como marcadores de riesgo.

Introduction: Patients with von Willebrand disease frequently bleed under haemostatic challenges. Objectives: The aim of our study was to identify predictive markers of perioperative major haemorrhage in type 1 and possible type 1 patients von Willebrand disease. Material and Methods: We recorded perioperative bleeding complications previous to diagnosis and laboratory parameters in 311 patients. They were grouped according to the absence (group A) or presence (group B) of perioperative major haemorrhage. Results: Twenty-six per cent of patients and 17.5 per cent of surgical procedures presented major haemorrhage. There was no difference neither between percentages of type 1 (32.6 per cent) and possible type 1 patients (24.8 per cent) who had major haemorrhage nor in the prevalence of O blood group, age, gender, family history and levels of FVIII and VWF, between group A and B. A history of bleeding after tooth extraction was the most frequent clinical feature (P<0.000; RR=2.11; CI 95 per cent = 1.3-3.5) observed in patients with major haemorrhage, and could defi ne risk factor. The bleeding score and the number of bleeding sites were not predictors of major haemorrhages. Caesarean sections (24.6 per cent) and adeno-tonsillectomies (22.3 per cent) showed the highest frequency of major haemorrhage. Conclusion: Type 1 and possible type 1 VWD patients showed similar incidence of perioperative major haemorrhage. The levels of FVIII and VWF, the bleeding time, blood group and family history did not prove to be effective as predictive markers of major haemorrhage. However, the personal history of bleeding after tooth extraction and the type of surgery (caesarean section and adeno-tonsillectomies) in patients with either type 1 or possible type 1 von Willebrand disease shown to be important in determining risk.

Efecto del inhibidor lúpico o anti-factor VIII sobre la actividad del factor VIII-sustrato cromogénico / Lupus anticoagulant or anti-factor VIII effect on factor VIII activity-chromogenic substrate

El objetivo del trabajo fue analizar el efecto de inmunoglobulinas (IgG) purificadas con actividad anti-factor VIII neutralizante o inhibidor lúpico, sobre el factor VIII medido por sustrato cromogénico (factor VIII SC), con el propósito de validar el método para detectar anti-factor VIII en presencia de inhibidor lúpico. Se aisló la fracción IgG (cromatografía de afinidad) a partir de plasmas normales (IgG-N), con anti-factor VIII (IgG-aFVIII) o con inhibidor lúpico (IgG-IL), preparándose un pool normal como aporte de factor VIII en los ensayos de inhibición. Se analizaron las mezclas del pool normal con IgG-N, IgG-aFVIII, IgG-IL o la combinación de IgG-aFVIII+IgG-IL, inmediatamente y luego de 2 h a 37 ºC, determinándose la actividad del factor VIII SC y el índice de inhibición inmediato (Ii) o post-incubación (Ip). La inhibición y la potenciación producida por IgG-aFVIII+IgG-IL (Ii:30%±0,7; Ip:55%±2,7), fueron similares a las observadas con IgG-aFVIII sola (Ii:30%±0,6; Ip:55%±2,7). La IgG-IL no afectó la actividad de factor VIII SC. Semejante a lo observado en plasma, la IgG-IL no interfirió en la inhibición del factor VIII SC mediada por IgG-aFVIII. Se confirmó así la especificidad del método amidolítico, que permite detectar inhibidores anti-factor VIII independientemente de la coexistencia con el inhibidor lúpico, solucionando el problema diagnóstico planteado en hemofilia A.

To analyse the effect of purified immunoglobulins (IgG) with anti-factor VIII or lupus anticoagulant activity on factor VIII measured by chromogenic substrate (factor VIIICS), in order to validate the chromogenic substrate method for detection of anti-factor VIII activity in the presence of lupus anticoagulant. IgG fractions were purified (affinity chromatography) from normal plasmas (IgG-N) and plasmas with anti-factor VIII (IgG-aFVIII) or lupus anticoagulant (IgG-LA). A normal plasma pool was prepared as source of factor VIII in the inhibition tests. Mixtures of this pool with IgG-N, IgG-aFVIII, IgG-LA or IgG-aFVIII+IgG-LA were tested immediately or after 2 h at 37 °C by factor VIIICS method; inhibition index (Ii) and post-incubation index (Ip) were calculated. The inhibitory and progressive inhibitory effects produced by IgG-aFVIII+IgG-LA (Ii:30%±0.7; Ip:55%±2.7) were similar to those observed with IgG-aFVIII (Ii:30%±0.6; Ip:55%±2.7). The IgG-LA did not inhibit the factor VIIIcs activity. As was observed in plasma samples, IgG-aFVIII and the mixture of IgG-aFVIII+IgG-LA inhibited factor VIIICS, whereas IgG-LA did not. These results confirm the specificity of the amidolytic method in detecting anti-factor VIII inhibitors independently of the presence of lupus anticoagulant, thus solving the diagnostic problem in haemophilia A.

Interrelación entre apoptosis del megacariocito y formación de plaquetas. Relevancia clínica / Interrelation between megakaryocyte apoptosis and platelet formation

En 1994 se caracterizó a la trombopoyetina como el principal regulador fisiológico del desarrollo megacariocítico y de la producción de plaquetas. A pesar de los importantes avances alcanzados en el conocimiento de los distintos pasos involucrados en la megacariocitopoyesis, el mecanismo molecular de la liberación de plaquetas a partir de megacariocitos maduros aún no está esclarecido. Una hipótesis es que la muerte celular o apoptosis del megacariocito sería el fenómeno que relaciona ambos eventos. El proceso de apoptosis está regulado por varias familias de proteínas: los receptores de muerte, las caspasas y la familia de proteínas Bcl-2. Recientemente se ha demostrado que en modelos de cultivo, entre los días 17 y 18, aproximadamente 50 por ciento de los megacariocitos presentan características de apoptosis y un aumento significativo del número de plaquetas. La proteína antiapoptótica Bcl-xl (miembro de la familia Bcl-2) sería necesaria para mantener la sobrevida de MCs en desarrollo y se liberaría con las plaquetas recién formadas permitiendo a los megacariocitos senescentes sufrir apoptosis y ser eliminados por los monocitos/macrófagos. La apoptosis de megacariocitos inmaduros que aún no son capaces de formar plaquetas sería la causa de la trombocitopenia observada en algunas patologías como síndrome mielodisplásico, trombocitopenia de radio y pacientes seropositivos para HIV.

Rol del óxido nítrico en la apoptosis del megacariocito / Nitric oxide role in megakaryocyte apoptosis

El óxido nítrico es uno de los metabolitos más pequeños biológicamente activo que regula distintos procesos fisiológicos y patofisiológicos en el sistema cardiovascular, inmune y nervioso. Hemos explorado recientemente su rol en la megacariocitopoyesis utilizando como modelo in-vitro el cultivo líquido de células mononucleares o de células indiferenciadas obtenidas a partir de médula ósea humana y estimuladas con trombopoyetina. Se observó que la generación de óxido nítrico de manera exógena es capaz de inhibir el crecimiento de los megacariocitos induciendo apoptosis tanto en células de estadios inmaduros como terminales por un mecanismo independiente de la guanilil ciclasa. La exposición de los cultivos a la L-arginina (sustrato fisiológico) o a una combinación de citoquinas proinflamatorias resultó en una supresión del crecimiento de los megacariocitos junto con un aumento significativo en los niveles de óxido nítrico. La presencia de inhibidores de la síntesis de óxido nítrico bloqueó su producción y revirtió parcialmente la inhibición del crecimiento de los megacariocitos. Nuestros resultados constituyen la primera evidencia de que el óxido nítrico inhibe el crecimiento de megacariocitos por inducción de apoptosis. Este hallazgo presenta nuevas perspectivas para comprender los fenómenos involucrados en la megacariocitopoyesis y en la formación de plaquetas.

Presente y futuro de los anticoagulantes orales / Present and future of the oral anticoagulants

El número de pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral se há incrementado notablemente en los últimos años al incorporarse la población de pacientes con fibrilación auricular crónica. Su manejo se há facilitado al contar actualmente con reactivos comerciales sensibles y calibrados. No obstante este avance, las complicaciones hemorrágicas siguen siendo uno de los peligros de este tratamiento. En nuestra experiencia las hemorragias mayores se correlacionan sobre todo con la intensidad de la anticoagulación y la duración del tratamiento. También la variabilidad del RIN (Razón Internacional Normatizada) (la desviación del RIN del rango deseado) puede asociarse con mayor sangrado. La necesidad de ajustar las dosis con pruebas de laboratorio, los controles frecuentes, la interacción con otras medicaciones, la estrecha ventana terapéutica y la alta variación en la relación dosis-respuesta hacen surgir la necesidad de nuevos agentes antitrombóticos, igualmente eficaces, pero que permitan prescindir del ajuste por el laboratorio, Inhibidores de trombina de bajo peso molecular disponibles por vía oral están actualmente en período de prueba y constituirían una alternativa al tratamiento con antagonistas de vitamina K.

Agregados de plaquetas y PMN en pacientes con reemplazo mecánico de válvula cardíaca / Circulating platelet/PMN aggregates in patients with mechanical heart valve replacement

El estudio de 50 pacientes con reemplazo mecánico de válvula cardíaca (MHVR), 50 pacientes control y 20 voluntarios sanos demostró que los pacientes MHVR presentan: a) aumento en la cantidad de agregados de plaquetas y leucocitos (MCA) en circulación, b) aumento en la expresión plaquetaria de P-selectina; c) aumento de la cantidad de fibrinógeno ligado a la superficie de plaquetas y de PMN; d) la proporción de MCA presentes en sangre entera aumentó luego de ser estimuladas con fMLP y e) la proporción de MCA formados in vitro por el estímulo con fMLP no se modificó al remover el calcio del medio. En conclusión, los resultados demuestran que los pacientes con MHVR presentan mayor MCA circulantes; que MCA parecerían ser dependientes de puentes de fibrinógeno y que los PMN de pacientes MHVR son capaces de incrementar y promover la formación y crecimiento de los MCA in vitro.

Reacción de liberación en tromboastenia de Glanzmann / Release reaction in Glanzmann's thrombasthenia

Se estudiaron siete pacientes con tromboastenia de Glanzmann. Se realizó agregación plaquetaria con reacción de liberación en un agregómetro Lumi. No se observó agregación con ADP, adrenalina o colágeno. El ácido araquidónico indujo una agregación de sólo 14,9%. Con ristocetina y con factor VIII bovino la aglutinación fue marcadamente disminuida. La liberación de ATP estuvo ausente con todos los agentes agregantes excepto con ácido araquidónico que provocó una liberación normal. Se realizó curva dosis respuesta con análogo de PGH2. Con dosis de 1 micronM a 100 micronM sólo se obtuvo una mínima agregación mientras que la liberación de ATP fue normal. Los resultados confirmarían la independencia de los mecanismos de agregación y liberación. La liberación de ATP inducida por ácido araquidónico o análogo de endoperóxido no parece requerir la exposición y fijación del fibrinógeno a su receptor