Résumé
Resumen Este trabajo tuvo como objetivo investigar la presencia de factores de virulencia, resistencia a antimicrobianos y metales pesados en 97 enterococos aislados de alimentos de origen animal. Se realizaron pruebas fenotípicas y genotípicas para la identificación a nivel de especie de los enterococos recuperados. Se identificaron 67 aislados como Enterococcus faecium, 9 como Enterococcus faecalis, 3 como Enterococcus durans, 2 como Enterococcus hirae y 1 como Enterococcus raffinosus. En 15 aislados no se logró su confirmación a nivel de especie por métodos fenotípicos ni genotípicos. La producción de exopolisacáridos fue el factor de virulencia más frecuente y se detectó en 46 enterococos, mientras que 19 exhibieron actividad gelatinasa y solo uno presentó beta-hemólisis. El estudio de la concentración inhibitoria mínima (CIM) reveló que 29 aislados resultaron resistentes a vancomicina (≥32 μg/mL) y 26 de ellos también eran resistentes a teicoplanina (≥32 μg/mL). Del total de aislamientos, 21 presentaron resistencia a tetraciclina (≥16 μg/mL) y sólo 3 exhibieron resistencia a la ampicilina (≥16 μg/mL). La prueba en agar reveló que 90 cepas resultaron resistentes al zinc (≥12 mM) mientras que todas exhibieron resistencia intermedia al cobre (4-12 mM). Los alimentos de origen animal actúan como reservorios de cepas de Enterococcus spp. que expresan factores de virulencia y resistencia a los antimicrobianos y a metales pesados. La implementación de una vigilancia continua en enterococos aislados de alimentos de origen animal es esencial para la salud humana.
Abstract This study was aimed at investigating the presence of virulence factors, antimicrobial and heavy metals resistance in 97 isolated enterococci from food of animal origin. Phenotypic and genotypic tests for species-level identification of the recovered isolates were carried out. This resulted in the iden tification of 67 strains as Enterococcus faecium, 9 as Enterococcus faecalis, 3 as Enterococcus durans, 2 as Enterococcus hirae and 1 as Enterococcus raffinosus. In 15 isolates, their confirmation at species level was neither achieved by phenotypic nor by genotypic methods. Exopolysaccharides production was the most frequent virulence factor and was detected in 46 isolates, while 19 displayed gelatinase activity, and only one resulted beta-hemolytic. Minimum inhibitory concentration (MIC) study revealed that 29 isolates were vancomycin-resistant (≥32 μg/mL), 26 of them were also resistant to teicoplanin (≥32 μg/mL). On the other hand, of the total isolates, 21 exhibited resistance to tetracycline (≥16 μg/mL) and only 3 enterococci exhibited resistance to ampicillin (≥16 μg/mL). Agar plates test revealed that 90 strains were resistant to zinc (≥12 mM) while all exhibited intermediate copper resistance (4-12 mM). Foods of animal origin act as a reservoir of Enterococcus spp. strains, expressing virulence factors, and resistance to antimicrobials and heavy metals. Therefore, the implementation of continuous surveillance in enterococci isolated from food of animal origin is essential to human health.
Resumo O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de fatores de virulência, resistência a antimicrobianos e metais pesados em 97 enterococos isolados de alimentos de origem animal. Foram realizadas provas fenotípicas e genotípicas para a identificação no nível de espécie dos enterococos recuperados. Foram identificados 67 isolados como Enterococcus faecium, 9 de Enterococcus faecalis, 3 de Enterococcus durans, 2 como Enterococcus hirae e 1 como Enterococcus raffinosus. Em 15 isolados, sua confirmação em nível de espécie não foi alcançada por métodos fenotípicos e/ou genotípicos. A produção de exopolissacarídeos foi o fator de virulência mais frequente e se detectou em 46 enterococos, enquanto que 19 apresentaram atividade de gelatinase e somente um apresentou beta-hemólise. O estudo da concentração inibitória mínima (CIM) revelou que 29 isolados eram resistentes à vancomicina (≥32 μg/mL), e 26 deles foram também resistentes a teicoplanina (≥32 μg/mL). Pelo contrário, da quantidade total de isolamentos, somente 21 apresentaram resistência à tetraciclina (≥16 μg/mL) e apenas 3 cepas apresentaram resistência à ampicilina (≥16 μg/mL). A prova em ágar revelou que 90 cepas eram resistentes ao zinco (≥12 mM), enquanto que todas mostraram resistência intermediária ao cobre (4-12 mM). Os alimentos de origem animal atuam como reservatórios de cepas de Enterococcus spp. os quais expressam fatores de virulência, e resistência aos antimicrobianos e a metais pesados. A implementação de uma vigilância contínua em enterococos isolados de alimentos de origem animal é essencial para a saúde dos humanos.
Résumé
Resumen Se aislaron del contenido intestinal del mejillón patagónico dos cepas de bacterias ácido lácticas y se caracterizaron por pruebas fenotípicas y moleculares. Los aislamientos se identificaron como Enterococcus hirae y fueron denominados E. hirae 463Me y 471Me. Por técnicas de PCR se identificó el gen de la enterocina P en ambas cepas, mientras que solamente en la cepa 471Me se detectó la enterocina hiracin JM79. Ambas cepas resultaron sensibles a los antibióticos clínicamente importantes y entre los rasgos de virulencia investigados mediante amplificación por PCR solo se pudieron detectar los genes cylL l y cylL s , sin embargo, no se observó actividad hemolítica en la prueba de agar sangre. Los sobrenadantes libres de células resultaron activos contra todas las cepas de Listeria y Enterococcus ensayadas, contra Lactobacillus plantarum TwLb 5 y contra Vibrio anguilarum V10. En óptimas condiciones de crecimiento, ambas cepas mostraron actividad inhibitoria contra Listeria innocua ATCC 33090 después de 2h de incubación. E. hirae 471Me alcanzó una actividad inhibitoria máxima de 163.840UA/ml después de 6h de incubación, mientras que el mismo valor se registró para E. hirae 463Me después de 8h. En ambos casos, la actividad antagonista alcanzó su máximo antes de lograr la fase estacionaria y permaneció estable hasta las 24h de incubación. En nuestro conocimiento, este es el primer informe de aislamiento de cepas bacteriocinogénicas de E. hirae de mejillón patagónico. La alta actividad inhibitoria y la ausencia de rasgos de virulencia indican que estos microorganismos podrían aplicarse en áreas biotecnológicas como la biopreservación de alimentos o las formulaciones probióticas.
Abstract Two bacteriocin-producing lactic acid bacterial strains were isolated from the intestinal content of the Patagonian mussel and characterized by phenotypic and molecular tests. The isolates were identified as Enterococcus hirae and named E. hirae 463Me and 471Me. The presence of the enterocin P gene was identified in both strains by PCR techniques, while enterocin hiracin JM79 was detected only in the 471Me strain. Both strains were sensitive to clinically important antibiotics and among the virulence traits investigated by PCR amplification, only cylL l and cylL s could be detected; however, no hemolytic activity was observed in the blood agar test. Cell free supernatants were active against all Listeria and Enterococcus strains tested, Lactobacillus plantarum TwLb 5 and Vibrio anguilarum V10. Under optimal growth conditions, both strains displayed inhibitory activity against Listeria innocua ATCC 33090 after 2h of incubation. E. hirae 471Me achieved a maximum activity of 163840AU/ml after 6h of incubation, while the same value was recorded for E. hirae 463Me after 8h. In both cases, the antagonist activity reached its maximum before the growth achieved the stationary phase and remained stable up to 24h of incubation. To our knowledge, this is first report of the isolation of bacteriocinogenic E. hirae strains from the Patagonian mussel. The high inhibitory activity and the absence of virulence traits indicate that they could be applied in different biotechnological areas such as food biopreservation or probiotic formulations.
Sujets)
Animaux , Bactériocines/biosynthèse , Mytilus edulis/microbiologie , Enterococcus hirae/isolement et purification , Enterococcus hirae/métabolisme , Contenus gastro-intestinaux/microbiologie , Enterococcus hirae/physiologieRésumé
Resumen Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana frente a bacterias multi-drogo resistentes, se estudiaron 234 cepas de actinobacterias aisladas de suelo de Argentina y Perú. Se seleccionaron 13 cepas sobre la base de su actividad antagonista contra Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SAMR) y Enterococcus resistente a vancomicina (EVR-van A y van B). La presencia de los genes NRPS, PKS-I y PKS-II fueron investigados por técnicas de PCR. Entre las 13 actinobacterias seleccionadas, la cepa AC69C mostró la mayor actividad en las pruebas de difusión en medio sólido y se evaluó posteriormente la producción de metabolitos antagonistas en medios líquidos. Los mejores resultados se lograron en caldo de fermentación con carbohidratos, al usarse en combinación almidón y glucosa. Se obtuvieron actividades antimicrobianas de 640 unidades arbitrarias (UA), 320 UA, 320 UA y 80 UA contra EVR-van A, EVR-van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 y SAMR, respectivamente. La amplificación por PCR del gen ARNr 16S y el análisis filogenético subsecuente de la cepa AC69C exhibieron una homología del 100 % con Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. No fue posible establecer una correlación entre los genes amplificados y la actividad antimicrobiana de las 13 cepas seleccionadas. Los resultados de este trabajo demuestran la amplia distribución de las actinobacterias en suelo y la importancia del aislamiento de cepas para la búsqueda de nuevos metabolitos activos contra bacterias multi-drogo resistentes de origen clínico.
Abstract Two hundred and thirty four actinobacteria strains were isolated from Argentinian and Peruvian soil in order to evaluate the antimicrobial activity against multidrug resistant bacteria On the basis of their antagonist activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and two vancomycin-resistant Enterococcus (EVR-Van A and EVR Van B),13 strains were selected. The presence of NRPS, PKS-I and PKS-II genes were also investigated by PCR techniques. Among the 13 selected actinobacteria, strain AC69C displayed the higher activity in diffusion tests in solid medium and was further evaluated for the production of antagonist metabolites in liquid media. The best results were obtained using fermentation broth with carbohydrates, when starch and glucose were used in combination. Antimicrobial activities of 640 arbitrary units , 320 AU, 320 AU and 80 AU were obtained against EVR-Van A, EVR-Van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 and MRSA, respectively. PCR amplification of 16S rRNA gene and subsequent phylogenetic analysis of AC69C strain displayed a 100 % homology with Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. It was not possible to establish a correlation between the amplified genes and antimicrobial activity of the 13 selected strains. The results of this work show the wide distribution of actinobacteria in soil and the importance of the isolation of strain to screen novel active metabolites against multidrug resistant bacteria of clinical origin.
Résumé
La contaminación por metales pesados (MP) constituye un problema creciente para la salud pública. La utilización de bioindicadores permite evaluar el impacto de la contaminación antrópica. En este estudio se evaluaron 730 cepas de Enterococcus provenientes de diferentes fuentes de la comarca VIRCh-Valdés (Provincia de Chubut), mediante la prueba de sensibilidad a Pb++ por el método de dilución en placa, a concentraciones comprendidas entre 50 mg/L y 1.200 mg/L. De las cepas evaluadas, 223 exhibieron resistencia a plomo a concentraciones ≥ 50 mg/L. Dentro de este grupo se seleccionaron 22 aislados altamente resistentes a plomo (≥ 800 mg/L) con el objetivo de evaluar su resistencia a otros metales pesados, resistencia a antibióticos y determinar sus factores de virulencia. Todas las cepas seleccionadas mostraron alta sensibilidad a Hg++, un patrón variable de resistencia frente a Cd++ y Cr+6 y resistencia moderada a Ni++. Las cepas resultaron susceptibles a ampicilina y penicilina, y presentaron un patrón variable de resistencia a los restantes antibióticos ensayados. Entre los factores de virulencia, se detectó actividad de gelatinasa en dos cepas y sólo una cepa exhibió actividad hemolítica. Estos resultados sugieren una relación entre la resistencia a metales pesados, resistencia a antibióticos y factores de virulencia en cepas de Enterococcus aisladas del medio ambiente.
Contamination by heavy metals is a growing problem for public health and the use of bio-indicators are means for assessing anthropogenic pollution. In this study 730 Enterococcus strains were isolated from different sources of the region VIRCh - Valdés (Province of Chubut) were tested for sensibility to Pb++ by the plate dilution method at concentrations ranging from 50 mg/L to 1200 mg/L. A total of 223 strains displayed resistance to lead at concentration ≥ 50 mg/L. Among this group, and on the basis of its high resistance to lead (≥ 800 mg/L), 22 strains were selected with the goal to determine antibiotic and heavy metal resistance pattern and also the presence of virulence traits. All isolates showed high sensibility to Hg++, a variable pattern against Cd++ and Cr+6, and moderate resistance to Ni++. The strains were all susceptible to ampicillin and penicillin and displayed a variable pattern of resistance towards the remaining antibiotics assayed. Among the virulence traits determined, gelatinase production was detected in 2 strains and only one isolate showed hemolytic activity. The results obtained in this work suggest a relationship between heavy metal resistance, antibiotic resistance and virulence factors in Enterococcus strains isolated from the environment.