Estimation, morphometry and ultrastructure of ovarian preantral follicle population in agouti (Dasyprocta leporina) / Morfometria, estimativa e ultraestrutura da população folicular ovariana preantral de cutia (Dasyprocta leporina)

The aim of this study was to characterize the preantral ovarian follicular population in agoutis (D. leporina) by estimating the number of follicles at each developmental category, and also describe the morphometry and the specific features of the follicle and the oocyte by using light and transmission electron microscopy. The length of each ovary was measured using a caliper rule, longitudinally sectioned into two halves and both were immediately fixed to perform the estimation of follicular population and ultrastructural analysis. The mean (±S.E.M.) population of follicular per pair of ovary was estimated at 4419.8±532.26 and 5397.52±574.91 for right and left ovaries, respectively, but no differences were observed between them. The diameters for follicles, oocyte and nuclei were: 18.62±3.40µm, 12.28±2.37µm and 6.10±0.93µm for primordial, 23.75±5.70µm, 14.22±3.00µm and 6.70±1.24µm for primary and 88.55±17.61µm, 52.85±17.56µm and 22.33±17.61µm for secondary follicles, respectively. The most of the follicles found belonged to the primordial category (86.63%), followed by primary (13.01%) and secondary (0.35%) one. Additionally, polyovular follicles were observed in all the animals and they represented 7.51% of the total follicles counted. The ultrastructural analysis showed that the oocyte presented a central and regular nuclei, displaying a homogenous mass. Among the organelles, the mitochondria were the most abundant and the oocyte Golgi apparatus was rarely observed. In conclusion, this work shows for the first time the characterization of the population of preantral follicles in the ovary of Dasyprocta leporina. Those information will be useful for further development and adaptation of biotechniques such as germplasm cryopreservation and in vitro gametes manipulation.(AU)

O objetivo deste trabalho foi caracterizar a população folicular ovariana pré-antral em cutias (D. leporina) estimando o número de folículos em cada categoria de desenvolvimento, e também descrever a morfometria e as características específicas do folículo e oócito usando microscopia de luz e eletrônica de transmissão. O comprimento de cada ovário foi medido utilizando um paquímetro, seccionados longitudinalmente em duas metades e ambos foram imediatamente fixados para realizar a estimativa da população folicular e análise ultraestrutural. A média (±S.E.M.) da população folicular por par de ovário foi estimada em 4419,8±532,26 e 5397,52±574,91 nos ovários direito e esquerdo, respectivamente, mas não foram observadas diferenças entre eles. Os diâmetros dos folículos, oócito e núcleos, respectivamente, foram: 18,62±3,40µm, 12,28±2.37µm e 6,10±0,93µm para primordial, 23,75±5,70µm, 14,22±3,00µm e 6,70±1,24µm para primário e 88,55±17,61µm, 52,85±17,56µm e 22,33±17,61µm de folículos secundários. A maioria dos folículos encontrados pertencia à categoria primordial (86,63%), seguido pelo primário (13,01%) e um secundário (0,35%). Adicionalmente, os folículos poliovulares foram observados em todos os animais e representavam 7,51% do total de folículos contados. A análise ultra-estrutural mostrou que o oócito apresentou núcleos centrais e regulares, exibindo uma massa homogênea. Dentre as organelas, as mitocôndrias foram as mais abundantes e o aparelho de Golgi do oócito foi raramente observado. Em conclusão, este trabalho mostra pela primeira vez a caracterização da população de folículos pré-antrais do ovário da Dasyprocta leporina. Essas informações serão úteis para o desenvolvimento e adaptação de biotécnicas, como a criopreservação de germoplasma e manipulação de gametas in vitro.(AU)

Identification of ultrastructural and functional damages in sperm from six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) due to cryopreservation / Identificação de danos ultraestruturais e funcionais em espermatozoides de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) oriundos da criopreservação

The aim of the study was to cryopreserve the semen of six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) in Tris-yolk and glycerol diluent, and to determine the damage caused by the freezing-thawing process, using fluorescent markers and ultrastructural analysis. Semen samples (n=11) collected from 4 adult six-banded armadillos by electroejaculation were cryopreserved in Tris diluent plus 20% egg yolk and 3% glycerol, in a fast freezing curve. Classical analysis of samples was performed after dilution, refrigeration and thawing, followed by fluorescence analysis, using a combination of fluorescent probes to assess membrane integrity (propidium iodide - PI and Hoechst - H342), and mitochondrial activity (CMXRos - Mito Tracker Red®). We also used the ultrastructural analysis to verify possible morphological alterations caused by cryoinjuries. When compared with fresh samples, we verified a significant decline in all the armadillos' semen parameters after thawing, in which only 6.1% motile sperm were found. However, the percentage of sperm which remained with viable (13%) and functional (24.7%) membranes after thawing suggests that some cells could be live but immotile. Analysis using fluorescent markers revealed that the mitochondria of armadillos' sperm is highly sensible to the freezing protocol and the findings through ultrastructure analysis proved this statement. Additionally, the images obtained by transmission electron microscopy revealed that frozen-thawed sperm presented damaged plasma membrane, nuclear modifications as changes in chromatin and acrossomal changes relative to sperm capacitation. In conclusion, this study is the first attempt to cryopreserve the semen of an armadillo species, and to help us to identify critical points on the freezing-thawing procedure in order to improve the protocol.(AU)

O objetivo deste estudo foi criopreservar o sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) em diluente Tris-gema e glicerol, e determinar os danos causados pelo processo de congelação-descongelação, utilizando marcadores fluorescentes e análise ultraestrutural. As amostras de sêmen (n=11) coletadas de 4 tatus-peba adultos por eletroejaculação foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de 20% de gema de ovo e 3% de glicerol, em curva rápida de congelação. A análise clássica das amostras foi realizada após a diluição, refrigeração e descongelação, seguida por análise de fluorescência, utilizando uma combinação de sondas fluorescentes para avaliar a integridade da membrana (Iodeto de Propídio - PI e Hoechst - H342), e a atividade mitocondrial (CMXRos - Mito Tracker RED®). Foi também utilizada a análise ultraestrutural para verificar possíveis alterações morfológicas causadas pela crioinjúria. Quando comparadas com as amostras a fresco, verificou-se uma queda significativa em todos os parâmetros seminais dos tatus após a descongelação, em que apenas 6,1% de espermatozoides móveis foram encontrados. No entanto, o percentual de espermatozoides que permaneceu com membrana viável (13%) e funcional (24,7%) após a descongelação sugere que algumas células podem estar vivas, mas imóveis. Análises utilizando marcadores fluorescentes revelaram que as mitocôndrias dos espermatozoides de tatus são altamente sensíveis ao protocolo de congelação e os achados através da análise ultraestrutural comprovaram esta afirmação. Além disso, as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão revelaram que espermatozoides congelados-descongelados apresentaram membranas plasmáticas danificadas, modificações nucleares como alterações na cromatina, e alterações acrossomais relativas à capacitação espermática. Em conclusão, este estudo é a primeira tentativa de criopreservação de sêmen em uma espécie de tatu, e nos auxiliou a identificar pontos críticos no processo de congelação-descongelação, a fim de melhorar o protocolo.(AU)

High-voltage electrical stimulation improves nerve regeneration after sciatic crush injury / Estimulação elétrica de alta voltagem favorece a regeneração nervosa após compressão do nervo isquiático

BACKGROUND: Peripheral nerve injury causes prolonged functional limitation being a clinical challenge to identify resources that accelerates its recovery. OBJECTIVES: To investigate the effect of high-voltage electrical stimulation (HVES) on the morphometric and functional characteristics of the regenerated nerve after crush injury in rats. METHODS: Twenty Wistar rats were randomly allocated into 4 groups: Control (CON) - without injury and without HVES; Denervated (D) - sciatic nerve crush only; Denervated + HVES - sciatic nerve crush and HVES; SHAM - without injury but HVES. The HVES and SHAM groups were stimulated (100 Hz; minimum voltage of 100 V, 20 μs, 100 μs interpulse interval) for 30 min/day, 5 days/week. The sciatic functional index (SFI) was evaluated before the injury and at the 7th, 14th and 21st postoperatory (PO) days. Neural components and the area density of connective tissue, blood vessels and macrophages were analyzed. RESULTS: Axonal diameter was higher on the HVES than on D group, reaching almost 80 percent above the control values after 21 days (p<0.05). Fiber diameter and myelin sheath thickness were higher on the HVES than on D group (p<0.05) reaching 96.5 percent and 100 percent of the control values, respectively. Functional recovery at the 14th PO day was better on group HVES. The macrophages and connective tissue area density was lower on the HVES group, while blood vessels number did not differ among groups. CONCLUSIONS: The HVES accelerated the functional recovery, potentiated the nerve fibers maturation and decreased macrophages and connective tissue area density, suggesting acceleration of neural repair.

CONTEXTUALIZAÇÃO: Lesões nervosas periféricas provocam limitação funcional prolongada, sendo um desafio para a clínica identificar recursos que acelerem sua recuperação. OBJETIVOS: Investigar a influência da estimulação elétrica de alta voltagem (EEAV) sobre a morfologia e a função do nervo regenerado após esmagamento em ratos. MÉTODOS: Vinte ratos Wistar foram divididos nos grupos: controle (CON) - sem lesão e sem EEAV; desnervado (D) - esmagamento do nervo isquiático; desnervado + EEAV (EEAV) - esmagamento do nervo e EEAV; SHAM - sem lesão, porém submetido à EEAV. Os grupos EEAV e SHAM foram estimulados (100 Hz, tensão mínima de 100 V; 20 μs e 100 μs interpulso) 30 min/dia, 5 dias/semana. O índice funcional do ciático (IFC) foi avaliado antes da lesão, nos 7º, 14º e 21º dias pós-operatório (PO). Componentes neurais, densidade de área de tecido conjuntivo, de vasos sanguíneos e macrófagos foram analisados. RESULTADOS: O diâmetro axonal foi maior no grupo EEAV que no grupo D, atingindo quase 80 por cento dos valores-controle após 21 dias (p<0,05). O diâmetro das fibras e espessura das bainhas de mielina foram maiores no grupo EEAV que no D (p<0,05), alcançando 96,5 por cento e 100 por cento dos valores-controle, respectivamente. A recuperação funcional no 14º dia PO foi melhor no grupo EEAV. A densidade de área de macrófagos e tecido conjuntivo foi menor no grupo EEAV, enquanto o número de vasos sanguíneos não diferiu entre os grupos. CONCLUSÕES: A EEAV acelerou a recuperação funcional, potencializou a maturação das fibras nervosas regeneradas e promoveu diminuição da densidade de área de macrófagos e tecido conjuntivo no nervo, sugerindo aceleração do reparo neural.