Résumé
RESUMEN La afinidad de la hemoglobina (Hb) por oxigeno (O2) es un factor importante que influye en el transporte de este gas, especialmente en hipoxia y en diferentes enfermedades como anemia o fibrosis quística. En la medición de la afinidad se usa la determinación de la curva de disociación Hb:O2. El método presentado para establecer la curva de disociación Hb:O2 (CDO) simplifica los protocolos normalmente utilizados, ya que elimina el requerimiento del equipo específico para equilibrar la sangre con oxígeno en niveles fijos de presión parcial (PO2). Mediante el uso de ecuaciones matemáticas es posible establecer la cinética de saturación de la hemoglobina (SO2) a valores crecientes de PO2. De igual forma, mediante el método se determinan aspectos típicos de la unión Hb: O2 como la dependencia del pH (coeficiente de Bohr) y el tipo de asociación de la proteína con su ligando mediante el diagrama de Hill. En virtud de la simplificación realizada, el método es aplicable en prácticas de laboratorio en población humana y animal, así como en la investigación de diferentes condiciones experimentales.
ABSTRACT The affinity of hemoglobin (Hb) for oxygen (O2) is an important factor influencing the transport of this gas especially in hypoxia and in different diseases such as anemia or cystic fibrosis. By the affinity measurement, the determination of the Hb: O2 dissociation curve is used. The presented method to establish the Hb: O2 oxygen dissociation curve (CDO) simplifies the protocols normally used, since it eliminates the requirement of specific equipment to equilibrate blood with oxygen at fixed levels of oxygen pressure (PO2). By using mathematical equations, it is possible to establish the saturation change of hemoglobin (SO2) at increasing oxygen partial pressure. Similarly, the method determines typical aspects of the Hb: O2 binding as the pH dependence (Bohr coefficient) and the association type of protein with its ligand by the Hill diagram. By this simplification, the method is applicable in laboratory practices in human and animal population, as well as in the investigation of different experimental conditions.
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Electrophoretic patterns of hemoglobins, Root effect, Bohr effect in blood and stripped hemoglobin, Hb-O2 affinity GTP modulation of Astyanax scabripinnis (lambari), caught at three different altitudes in Ribeirão Grande, near Campos do Jordão (São Paulo), are described. All populations showed the same electrophoretic patterns: two cathodal components in starch gel. Normal Bohr effect values were found in these three populations both in blood (phi = -0,11) and stripped hemoglobin (phi = -0,12). Different blood O2 affinities collected in fish of these 3 populations were detected. GTP has a large influence on Hb-O2 binding properties in A. scabripinnis. Stripped hemoglobin shows small Root effect. The addition of triphosphated nucleotides increases this effect. GTP is more effective than ATP on enhancing Root effect. Oxygen availability in water can be the factor responsible for differences found in blood O2 affinity.
Padrão eletroforético de hemoglobina, efeito Root, efeito Bohr em sangue e em Hb stripped e efeito do GTP na afinidade Hb-O2 de Astyanax scabripinnis (lambari) coletados em três altitudes diferentes no Ribeirão Grande, na região de Campos do Jordão (São Paulo), são descritos. Todas as populações mostraram os mesmos padrões eletroforéticos: dois componentes catódicos em gel de amido. Efeito Bohr normal foi encontrado para as três populações, tanto em sangue (fi = -0,11) quanto em Hb stripped (fi = -0,12). Detectamos afinidades diferentes da hemoglobina ao O2 entre as três populações estudadas. GTP possui forte influência nas propriedades de ligação da hemoglobina ao oxigênio em Astyanax scabripinnis. Em hemoglobina stripped, o efeito Root é baixo. A adição de nucleotídeos trifosfatados aumenta esse efeito. GTP é mais efetivo que ATP no aumento desse efeito. A disponibilidade de O2 na água pode ser o fator responsável pelas diferenças encontradas nas afinidades da hemoglobina pelo oxigênio.
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The hemolysate from Geochelone denticulata contains two main hemoglobin components, as shown by ion exchange chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Electrophoresis under dissociating conditions showed three types of globin chains. The apparent molecular mass, as determined by gel filtration on Sephadex G-200, was compatible with tetrameric Hb, which was unable to polymerize. The G. denticulata Hb has a P50 value of 9.56 mm Hg at pH 7.4. The Hb oxygenation appears to be under the control of organic phosphates and hydrogen ion since it is strongly affected by those species. In the presence ATP or IHP the P50 values increased to 29.51 mm Hg and 54.95 mm Hg, respectively, at pH 7.4. The n50 was generally lower than 1.5 in stripped Hb, suggesting a dissociation of tetramers. In the presence of organic phosphates n50 values increased to approximately 2.5. The Bohr effect was evident in oxygen equilibrium experiments. The hematocrit (32%) and Hb concentration (5.7 mM as heme) of G. denticulata blood were substantially larger than those of G. carbonaria, but the methemoglobin levels were similar in both species, approximately 1%. Thus, the oxygen capacity of blood appears to be higher in G. denticulata than in G. carbonaria, particularly considering the functional properties of their Hbs, which would guarantee the survival of animals.
O hemolisado de Geochelone denticulata contém dois componentes principais, de acordo com a cromatografia de troca iônica e PAGE. Eletroforese sob condições dissociantes mostrou 3 tipos de cadeias de globina. A massa molecular aparente, determinada pela filtração em gel sobre Sephadex G-200, foi compatível com Hb tetramérica que foi incapaz de polimerizar. A Hb de G. denticulata tem valor de P50 de 9,56 mm Hg em pH 7,4. A oxigenação da Hb parece estar sob controle de fosfatos orgânicos e íons hidrogênio, uma vez que ela é fortemente afetada por essas espécies. Na presença de ATP ou IHP, os valores de P50 aumentaram para 29,51 mm Hg e 54,95 mm Hg, respectivamente, a pH 7,4. O n50 foi geralmente menor que 1,5 na Hb stripped, sugerindo dissociação de tetrâmeros. Na presença de fosfatos orgânicos, os valores de n50 aumentaram para aproximadamente 2,5. O efeito Bohr foi evidente nos experimentos de equilíbrio com oxigênio. O hematócrito de 32% e a concentração de Hb de 5,7 mM em heme no sangue de G. denticulata foram substancialmente maiores do que da G. carbonaria, mas os níveis de metahemoglobina foram similares em ambas as espécies, aproximadamente 1%. Portanto, a capacidade de oxigenação do sangue parece ser maior na G. denticulata, particularmente considerando as propriedades funcionais da Hb, que garantiria a sobrevivência dos animais.
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Hematological parameters, intraerythrocytic phosphates, hemoglobin, and whole blood Bohr effect of the South American armored catfish Hoplostenum littorale were studied during different seasons of the year. In addition, the degree of dependence on air breathing was determined for this species. The hematological parameters presented seasonal variations, which were not correlated to oxygen, temperature, and water level oscillations. Five anodic hemoglobin fractions were detected in starch gel electrophoresis. In addition to ATP, GTP and Fe-GTP being detected, 2,3-DPG was also detected in red blood cells of H. littorale. The latter is an intraerythrocytic phosphate characteristic to red blood cells of mammalians. The increased production of 2,3-DPG could be associated with decreasing Hb-O2 affinity and both features could be related to environmental temperature increase. Whole blood Bohr effect was influenced by water temperature. This study confirms H. littorale to be continuous and not obligate air breather, under all dissolved oxygen level conditions.
Os parâmetros hematológicos, os fosfatos intraeritrocitários, a hemoglobina e o efeito Bohr do sangue de Hoplostenum littorale foram estudados em diferentes períodos do ano. Além disso, foi determinado o grau de dependência da respiração aérea nesta espécie. Os parâmetros hematológicos apresentaram variações sazonais, as quais não foram relacionadas com as variações no oxigênio dissolvido, temperatura e nível de água. Além de ATP, GTP e Fe-GTP terem sido detectados nos eritrócitos de H. littorale, 2,3-DPG também foi detectado. Este último é um fosfato intraeritrocitário característico de células vermelhas de mamíferos. O efeito deste composto sobre a afinidade da Hb-O2 pode estar relacionado com o aumento da temperatura. O efeito Bohr do sangue foi influenciado pela temperatura da água. Este estudo confirma que H. littorale é um respirador aéreo facultativo que utiliza a respiração aérea mesmo em condições normóxicas.