Genetic diversity of Babesia bovis studied longitudinally under natural transmission conditions in calves in the state of Rio de Janeiro, Brazil / Diversidade genética de Babesia bovis estudada longitudinalmente em condições de transmissão natural entre bezerros no estado do Rio de Janeiro, Brasil

Abstract Serum and DNA samples from 15 naturally infected calves in Seropédica, Brazil, were obtained quarterly from birth to 12 months of age, in order to longitudinally evaluate their humoral immune response against Babesia bovis and the merozoite surface antigen diversity of B. bovis. Anti-B. bovis IgG antibodies were detected by an indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Using DNA amplification, sequencing and phylogenetic analysis, the genetic diversity of B. bovis was assessed based on the genes that encode merozoite surface antigens (MSA-1, MSA-2b and MSA-2c). The serological results demonstrated that up to six months of age, all the calves developed active immunity against B. bovis. Among the 75 DNA samples evaluated, 0, 3 and 5 sequences of the msa-1, msa-2b and msa-2c genes were obtained, respectively. The present study demonstrated that the msa-2b and msa-2c gene sequences amplified from blood DNA of B. bovis-positive calves were genetically diversified. These data emphasize the importance of conducting deeper studies on the genetic diversity of B. bovis in Brazil, in order to design diagnostic antigens and vaccines in the future.

Resumo Para avaliar longitudinalmente a resposta imune humoral anti-B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, entre bezerros naturalmente infectados em Seropédica, Brasil, amostras de soro e DNA de 15 bezerros foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até 12 meses de idade. Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto. Usando-se amplificação de DNA, sequenciamento e análises filogenéticas, a diversidade genética de B. bovis, com base nos genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSA-1, MSA-2b e MSA-2c) foi investigada. Os resultados da sorologia demonstraram que, até os seis meses de idade, todos os bezerros desenvolveram imunidade ativa contra B. bovis. Entre as 75 amostras de DNA avaliadas, foram obtidas 0, 3 e 5 sequências dos genes msa-1, msa-2b e msa-2c. O presente estudo demonstrou que sequências dos genes msa-2b e msa-2c amplificadas a partir de amostras de sangue positivas para B. bovis de bezerros de Seropédica, foram geneticamente distintas. O presente trabalho realça a importância de se realizar estudos aprofundados sobre a diversidade genética de B. bovis no Brasil, objetivando o desenvolvimento de antígenos para o diagnóstico e vacinas no futuro.

Longitudinal evaluation of humoral immune response and merozoite surface antigen diversity in calves naturally infected with Babesia bovis, in São Paulo, Brazil / Avaliação longitudinal da resposta immune humoral e diversidade de antígenos de superfície de merozoítos em bezerros naturalmente infectados com Babesia bovis, em São Paulo, Brasil

Abstract Babesiosis is an economically important infectious disease affecting cattle worldwide. In order to longitudinally evaluate the humoral immune response against Babesia bovis and the merozoite surface antigen diversity of B. bovis among naturally infected calves in Taiaçu, Brazil, serum and DNA samples from 15 calves were obtained quarterly, from their birth to 12 months of age. Anti-B. bovis IgG antibodies were detected by means of the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polymerase chain reaction (PCR) was used to investigate the genetic diversity of B. bovis, based on the genes that encode merozoite surface antigens (MSA-1, MSA-2b and MSA-2c). The serological results demonstrated that up to six months of age, all the calves developed active immunity against B. bovis. Among the 75 DNA samples evaluated, 2, 4 and 5 sequences of the genes msa-1, msa-2b and msa-2c were obtained. The present study demonstrated that the msa-1 and msa-2b genes sequences amplified from blood DNA of calves positive to B. bovis from Taiaçu were genetically distinct, and that msa-2c was conserved. All animals were serologically positive to ELISA and IFAT, which used full repertoire of parasite antigens in despite of the genetic diversity of MSAs.

Resumo A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo. Para avaliar longitudinalmente a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, entre bezerros naturalmente infectados em Taiaçu, Brasil, amostras de soro e DNA de 15 bezerros, foram obtidos trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto. A Reação em Cadeia da Polimerase foi utilizada para investigar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSA-1, MSA-2b e MSA-2c). Os resultados da sorologia demonstraram que até seis meses de idade todos os bezerros desenvolveram imunidade ativa contra B. bovis. Entre as 75 amostras de DNA avaliadas, foram obtidas 2, 4 e 5 sequências dos genes msa-1, msa-2b e msa-2c. O presente trabalho demonstrou que as sequências dos genes msa-1 e msa-2b amplificadas do DNA do sangue de amostras positivas a B. bovis de bezerros de Taiaçu foram geneticamente distintas, e msa-2c conservadas. Todos os animais foram soropositivos ao ELISA e ao IFAT, os quais utilizaram o repertório completo de antígenos parasitários, apesar da diversidade genética dos MSAs.

Bovine babesiosis and anaplasmosis complex: diagnosis and evaluation of the risk factors from Bahia, Brazil / Complexo tristeza parasitária bovina: diagnóstico e avaliação dos fatores de risco na Bahia, Brasil

Direct diagnoses were made by using - blood smears and nested PCR (nPCR) tests on 309 blood samples from crossbred dairy cattle in the municipality of Ibicaraí, Bahia. From diagnostic blood smear slides, the observed parasitic frequencies were 31.1% for Anaplasma marginale and 20.4% for Babesia sp. From nPCR diagnoses, they were 63% for A. marginale, 34% for Babesia bigemina and 20.4% for Babesia bovis. There were significant differences (P <0.01) between the two diagnostic methods (nPCR and blood smear slides). The compliance obtained from the kappa test was 0.41 and 0.48 for A. marginale and Babesia sp., respectively. The tick samples from the six farms analyzed using nPCR were only positive for A. marginale. Evaluation of the risk factors relating to the presence of ticks and the age of the animals showed that there was a significant association (P <0.01) with the frequency of animals infected with both pathogens. Therefore, under the conditions studied, nPCR proved to be a good tool for diagnosing the agents of the bovine babesiosis and anaplasmosis complex because of its sensitivity and specificity in comparison with blood smears. The municipality of Ibicaraí is an area with endemic prevalence of bovine babesiosis and anaplasmosis confirmed by nPCR and A. marginale is the main agent of the disease.

Realizou-se o diagnóstico direto por esfregaço sanguíneo e nested PCR (nPCR) em 309 amostras de sangue de bovinos mestiços leiteiros provenientes do município de Ibicaraí, Bahia. A frequência observada no diagnóstico por lâminas de esfregaço sanguíneo foi 31,1% para Anaplasma marginale e 20,4% para Babesia sp. Enquanto que no diagnóstico por nPCR foi 63% para A. marginale, 34% para Babesia bigemina e 20,4% Babesia bovis. Verificaram-se diferenças significativas (P<0,01) na comparação entre os dois métodos de diagnósticos (nPCR e esfregaço sanguíneo). A concordância ao teste KAPPA obtida foi de 0,41 e 0,48 para A. marginale e Babesia sp., respectivamente. As amostras de carrapatos das seis propriedades analisadas por nPCR foram positivas apenas para A. marginale. Na avaliação dos fatores de risco verificou-se que a presença de carrapato e idade dos animais apresentaram associação significativa (P<0,01) com a frequência de animais infectados por ambos os patógenos analisados por nPCR. Portanto, nas condições estudadas, a nPCR revelou-se uma boa ferramenta para diagnóstico dos agentes do complexo tristeza parasitária bovina (TPB) devido a sensibilidade e especificidade, quando comparado ao esfregaço sanguíneo. O município de Ibicaraí apresenta-se como uma área endêmica para TPB com prevalência comprovada através de nPCR e, A. marginale o principal agente encontrado.

La vacunación simultánea de bovinos con Lactobacillus casei y la vacuna bivalente contra babesiosis bovina genera una mejor protección contra Babesia bovis y B. bigemina transmitidas por garrapatas en condiciones extremas de campo / The simultaneous vaccination of bovines with Lactobacillus casei and the bivalent vaccine against bovine babesiosis induces a better protection against Babesia bovis and B. bigemina transmitted by ticks in extreme field conditions

The effect of Lactobacillus casei on INIFAP's mixed vaccine against bovine babesiosis (VAC) was assessed in bovines in an endemic babesiosis area. It was previously reported that L. casei increases the efficiency of the Mexican mixed vaccine against bovine babesiosis under controlled conditions. The results of the present study demonstrated the effectiveness of simultaneous vaccination of bovines with L. casei and the mixed vaccine against bovine babesiosis in eliciting a protective immune response under extreme conditions in the field. Twenty Babesia spp free bovines were allocated into three groups: un-vaccinated (Control, n = 9), vaccinated with VAC (n = 5), and vaccinated simultaneously with VAC and Lactobacillus casei (LC-VAC, n = 6). All animals were kept in a tick and Babesia spp free field at Coatepec, Veracruz during 24 days before moving them to Paso del Toro, Veracruz, for a natural exposition to Babesia spp transmitted by Riphicephalus (Boophilus) microplus ticks. Protection against Babesia spp was observed in bovines belonging to VAC and LC-VAC groups, while control animals showed severe clinical babesiosis. Bovines in VAC-LC group showed less clinical signs between days 12-16 after challenge as compared with animals in VAC group. All bovines showed both Babesia spp after challenge. Levels of IgG anti-Babesia in animals from both vaccinated groups, determined by indirect immunofluorescence test, always were higher to Babesia bovis than to B. bigemina after vaccination and challenge. It was demonstrated the efficiency of simultaneous vaccination of bovines with VAC and L. casei, in eliciting a better protective immune response against naturally transmitted Babesia spp under extreme field conditions.

Se evaluó el efecto de Lactobacillus casei en la vacuna mixta contra babesiosis bovina del INIFAP (VAC), en bovinos de un área endémica de babesiosis. Previamente se informó que L. casei incrementa la eficacia de la vacuna mixta mexicana contra babesiosis bovina bajo condiciones controladas. Los resultados aquí expuestos demostraron dicha efectividad para generar una respuesta inmunitaria protectora bajo condiciones extremas en el campo. Veinte bovinos libres de Babesia spp fueron distribuidos al azar en tres grupos: testigo no vacunado (Testigo, n = 9), vacunado con VAC (n = 5), y vacunado simultáneamente con VAC y L. casei (LC-VAC, n = 6). Todos los animales se mantuvieron en un corral libre de garrapatas y Babesia spp en Coatepec, Veracruz durante 24 días antes de transportarlos a Paso del Toro, Veracruz, para una exposición natural a Babesia spp transmitida por garrapatas Riphicephalus (Boophilus). Se observó protección contra Babesia spp en bovinos pertenecientes a los grupos VAC y LC-VAC, mientras que los animales testigo mostraron signos clínicos de babesiosis aguda. Los bovinos del grupo VAC-LC mostraron menos signos clínicos que los del grupo VAC entre los días 12-16. Todos los bovinos mostraron Babesia spp después de la confrontación. Los niveles de IgG anti-Babesia en los animales de los grupos vacunados, determinados por inmunofluorescencia indirecta, siempre fueron más elevados contra Babesia bovis que contra B. bigemina después de la vacunación y de la confrontación. Se demostró la eficacia de la vacunación simultánea con VAC y L. casei en bovinos, para generar una mejor respuesta inmunitaria protectora contra Babesia spp transmitida naturalmente por garrapatas, bajo condiciones extremas de campo.

Detection of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil / Detecção de anticorpos anti-Babesia bovis e anti-Babesia bigemina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil

The aim of this study was to determine the seroprevalence of antibodies against B. bovis and B. bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil. In this research we used sera obtained from 506 calves, from both genders and of 8 to 24 months old, to detect antibodies by indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA-test). Statistical analysis of the data was performed using the Chi-square (χ2) test with Yates correction. The seroprevalence obtained was 90.5 and 91.7 percent for B. bigemina and B. bovis, respectively, characterizing the region as an area of enzootic stability for the species analyzed. The seroprevalence to B. bovis showed higher positivity among calves 19-24 months old.

O objetivo desse estudo foi determinar a soroprevalência de anticorpos anti-B. bovis e anti-B. bigemina em bezerros da região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Nesta pesquisa foram coletadas 506 amostras de soros de bezerros com faixa etária entre 8 e 24 meses, fêmeas e machos, as quais foram processadas pelo ensaio imunoenzimático indireto (ELISA-teste). Como análise estatística utilizou-se o Qui-Quadrado (χ2) com correção de Yates. As prevalências obtidas em bezerros foram de 90,5 e 91,7 por cento para B. bigemina e B. bovis, respectivamente, caracterizando esta região como de estabilidade enzoótica para as espécies analisadas. A soroprevalência para B. bovis apresentou maior positividade entre os bezerros com faixa etária de 19-24 meses.