Résumé
Abstract: Introduction: Routine diagnosis for bovine leukemia is performed using indirect serologic tests, although it is recommended to use polymerase chain reaction (PCR), which allows a reliable diagnosis in early stages and in young animals. Moreover, by amplifying the DNA, it is possible to sequence fragments of the virus, which allows to identify genotypes and to construct phylogenetic trees. Objective: To analyze a fragment of the env gene of bovine leukemia virus (BLV) isolated from indirect ELISA-positive animals in dairy farms in the municipality of Pasto (Nariño). Materials and methods: Once the presence of BLV was established in 48 animals over two years old in seven dairy farms in the municipality of Pasto by indirect ELISA test, a nested PCR test was performed to confirm diagnosis and to sequence a fragment of the env gene in positive animals and their daughters. The sequences obtained were compared with the seven genotypes described worldwide by MEGA 6 program. Results: The sequences of the compared fragments do not differ from those described; but they allow their grouping into different clusters according to their similarity. The genotypes found in these farms correspond to genotype 1 and 2 described in the literature. Conclusions: Only one genotype was found on farms with proper recovery and adequate biosecurity measures, and on farms with less control in management and recovery practices, both genotypes described for the region were evident.
Resumen: Introducción: El diagnóstico de rutina para la leucosis bovina se realiza con pruebas serológicas indirectas, aunque se recomienda usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite un diagnóstico confiable en fases iniciales y en animales jóvenes. Además, mediante la amplificación del ADN se pueden secuenciar fragmentos del virus, que permite identificar los genotipos presentes y construir árboles filogenéticos. Objetivo: Analizar un fragmento del gen env del virus de leucosis bovina (VLB) aislado de animales positivos a ELISA indirecta en fincas lecheras del municipio de Pasto, Nariño. Materiales y métodos: Una vez establecida la presencia del VLB en 48 animales mayores de dos años en siete fincas lecheras del municipio de Pasto mediante la prueba de ELISA indirecta, se realizó una prueba de PCR anidada para confirmar el diagnóstico y secuenciar un fragmento del gen env en los animales positivos y sus hijas. Las secuencias obtenidas se compararon con los siete genotipos descritos en el mundo mediante el programa MEGA 6. Resultados: Las secuencias de los fragmentos comparados no difieren de las descritas; pero permiten su agrupación en diferentes clústeres de acuerdo con su similitud. Los genotipos encontrados en estas fincas corresponden al genotipo 1 y 2 descritos en la literatura. Conclusiones: En las fincas con reposición propia y adecuadas medidas de bioseguridad solo se encontró un genotipo y en las fincas con menor control en las prácticas de manejo y de reposición se encontraron los dos genotipos descritos para la región.
Resumo: Introdução: O diagnóstico de rotina para a leucose bovina se realiza com provas serológicas indiretas, mesmo que se recomenda usar a reação em cadeia da polimerase (PCR), que permite um diagnóstico confiável em fases iniciais e em animais jovens. Além do mais, mediante a amplificação do ADN se podem sequenciar fragmentos do vírus, que permite identificar os genótipos presentes e construir árvores filogenéticas. Objetivo: Analisar um fragmento do gene env do vírus de leucose bovina (VLB) isolado de animais positivos a ELISA indireta em fazendas leiteiras do município de Pasto, Nariño. Materiais e métodos: Uma vez estabelecida a presença do VLB em 48 animais maiores de dois anos em sete fazendas leiteiras do município de Pasto mediante a prova de ELISA indireta, se realizou uma prova de PCR aninhada para confirmar o diagnóstico e sequenciar um fragmento do gene env nos animais positivos e suas filhas. As sequências obtidas foram compararam com os sete genótipos descritos no mundo mediante o programa MEGA 6. Resultados: As sequências dos fragmentos comparados não diferem das descritas; mas permitem a sua agrupação em diferentes clusters de acordo com sua similitude. Os genótipos encontrados nestas fazendas correspondem ao genótipo 1 e 2 descritos na literatura. Conclusões: Nas fazendas com reposição própria e adequadas medidas de biossegurança somente se encontrou um genótipo e nas fazendas com menos controle nas práticas de manejo e de reposição se encontraram os dois genótipos descritos para a região.
Résumé
Bovine feedlots are intensive production systems of significant importance in Mexico. The present study describes the presence of bovine virus diarrhea (BVD) causing subacute to chronic lesions in feedlot cattle, associated with other pathologies. Animals included in this study were discarded after they received therapy several times due to chronic pneumonia, or anaplamosis. Bovine virus diarrhea antigen was identified by immunohistochemistry in small intestine and myocardium in six cases of chronic suppurative bronchopneumonia with extensive areas of casseous necrotic bronchiectasis, previously diagnosed as Mycoplasma bovis pneumonias (retrospective group, n = 6). Furthermore, based on characteristic histopathologic lesions other nine cases were included (prospective group, n = 9). Bovine virus diarrhea antigen was recognized in two animals with pneumonic lesions, including a case with fibrinous bronchopneumonia as well as suggestive lesions of infectious bovine rinotracheitis (1/9), and another one with suppurative bronchopneumonia and myocarditis suggestive of Histophilus somni (1/9). In addition, one positive case was associated to anaplasmosis (1/9). Other two positive cases showed a conspicuous fibrinous peritonitis (2/9). The rest of the animals in this group resulted negative (4/9). Histopathological characteristics of the lesions and their association with the antigen in situ confirm the presence of BVD. This presentation is compatible with the acute infection syndrome. This is the first report of BVD infection and concomitant pathologies in feedlot cattle in Mexico.
El ganado en corral de engorda es un sistema de producción intensivo de gran importancia en México. En este trabajo se describe la infección por diarrea viral bovina (DVB), ocasionado por lesiones subagudas y crónicas en bovinos en corral de engorda, y su asociación con otras patologías. Los animales de este estudio fueron considerados de rechazo después de ser tratados en diferentes ocasiones por enfermedad respiratoria, o bien anaplasmosis. El antígeno de DVB fue identificado por inmunohistoquímica (IHQ) en intestino delgado y miocardio en seis casos de bronconeumonía supurativa crónica con extensas áreas de bronquiectasia con necrosis caseosa, los cuales habían sido previamente diagnosticados como neumonías por Mycoplasma bovis (grupo retrospectivo, n = 6). Además, se incluyeron otros nueve casos con base en las características histopatológicas de las lesiones (grupo prospectivo, n = 9). El antígeno de DVB se reconoció en dos animales con lesiones neumónicas, uno de ellos con bronconeumonía fibrinosa, incluyendo además lesiones probables de rinotraqueítis infecciosa bovina (1/9), y el otro con bronconeumonía supurativa y también miocarditis probable por Histophilus somni (1/9). Adicionalmente, un caso positivo estuvo asociado a anaplasmosis (1/9). Otros dos casos positivos presentaron una distintiva peritonitis fibrinosa (2/9). El resto de los animales de este grupo resultaron negativos a DVB (4/9). Las características histopatológicas de las lesiones y su asociación con el antígeno in situ, confirman la presencia de DVB. Esta presentación es compatible con el síndrome denominado infección aguda. Este es el primer informe de infección por DVB y otras patologías concomitantes en ganado de engorda en México.
Résumé
Objective: real time PCR analysis for the detection of seven bovine pathogenic viruses: Bovine Adenovirus (BAdV), Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Bovine Parainfluenza Virus 3 (BPIV-3), Bovine Herpes Virus-1 (BoHV-1), and Mycoplasma was conducted using fetal bovine serum (FBS, MICROGEN®) obtained in Colombia, aiming to include it as part of the serum quality control. Methods: bovine derived MDBK and human derived HEp-2 cell lines were cultured with the test serum for 21 days, collecting supernatant and cellular samples every 7-days. Once DNA and RNA were extracted, the later was converted into cDNA and both samples were subjected to real time PCR using specific primers and Resolight® (DNA-binding fluorescent dye). Standard curves were generated using serial dilutions of cloned specific viral sequences. Accurate amplification and high efficiency was demonstrated in these reactions. Results: realtime PCR amplification did not show a persistent increase of viral counts in cultures during the 21-day follow-up. However, for vesicular stomatitis virus, a transient increase was observed at 7 and 14 days in both cell lines, but considered as not conclusive for viral presence. Conclusions: real time PCR analysis showed to be a suitable method for viral detection in fetal bovine serum samples and through this method no consistent viral or mycoplasma presence was detected in the MICROGEN® fetal bovine serum.
Objetivos: se empleó el método de PCR en tiempo real para detectar los virus patógenos bovinos: Adenovirus bovino (BAdV), virus de la diarrea Viral Bovina tipos 1 y 2 (BVDV-1 y BVDV-2), Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), Virus de la Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV-3), Herpesvirus Bovino-1 (BoHV-1) y Mycoplasma, en suero fetal bovino (FBS, MICROGEN ®)obtenido en Colombia, con el objetivo de incluir estos análisis en el control de calidad del FBS. Metodos: las líneas celulares MDBK de origen bovino y HEp-2 de origen humano se cultivaron con el FBS MICROGEN® por 21 días, tomando muestras de cultivos y sobrenadantes cada 7 días. Una ves extraido el DNA y RNA, a partir de este último se sintetizó cDNA, y en los dos tipos de muestras se analizó la presencia de los agentes patógenos mencionados por PCR en tiempo real empleando iniciadores específicos para cada uno y Resolight® (colorante fluorescente de unión a DNA). Se generaron curvas estándar con diluciones seriadas de secuencias virales específicas clonadas en plásmidos, que mostraron amplificación específica y altas eficiencias. Resultados: el análisis de los cultivos mantenidos con el FBS en estudio no mostró aumento del número de copias virales detectadas a lo largo del periodo de 21 días de seguimiento, excepto para el virus de la estomatitis vesicular, que mostró un incremento transitorio en los sobrenadantes de los cultivos de las dos líneas celulares a los 7 y 14 días de cultivo, que no se consideró concluyente para la presencia del virus. Conclusiones: el método de PCR en tiempo real mostró utilidad para la detección de virus patógenos y mycoplasma en FBS, y mediante este método no se obtuvieron resultados que permitan concluir que los patógenos virales o los mycoplasmas están presentes en los cultivos mantenidos con el suero fetal bovino MICROGEN®.
Objetivo: Foi utilizado o método de PCR em tempo real para detectar os vírus patogénicos bovinos: Adenovírus Bovino (BAdV), Vírus da Diarreia Viral (BVDV-1 e BVDV-2), Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV ), Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), Vírus da Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV- 3), Herpesvírus Bovino-1 (BoHV-1) e Mycoplasma, em soro fetal bovino (FBS, Microgen®) obtido na Colômbia, de modo a incluir esta análise no controle de qualidade FBS. Métodos: as linhas celulares de MDBK de origem bovina e HEp-2 de origem humana foram cultivadas com FBS Microgen® durante 21 dias, tomando amostras de cultura e sobrenadantes cada 7 dias. Uma vez retirado o DNA e RNA, foi sintetizado o cDNA a partir do RNA. Nos dois tipos de amostras foram analisadas para determinar a presença de patógenos mencionados por PCR em tempo real usando primers específicos para cada um e Resolight®(corante fluorescente de união à DNA). As curvas padrão foram geradas com diluições em série de sequências virais específicas, clonadas em Resultados: plasmídeos, que mostram amplificação específica e altas eficiências. a análise das culturas mantidas em FBS em estudo, não mostraram aumento no número de cópias virais detectadas ao longo do período de 21 dias de seguimento, exceto para o vírus da estomatite vesicular, que mostrou um aumento transitório nos sobrenadantes das culturas de duas linhas celulares aos 7 e 14 dias de cultura, que não foi considerado conclusivo para a presença do vírus. Conclusões: O método de PCR em tempo real foi útil para a detecção de vírus patogênicos e mycoplasma em FBS, e por este método foram obtidos resultados que demonstram que patógenos virais ou mycoplasmas estão presentes nas culturas mantidas com soro fetal bovino Microgen®.