Caracterización del perfil quimiosensibilidad y del estado de ampliación génica de un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar / Characterization of chemosensitivity profile gene amplification status of a panel of lung cancer cell lines

En este trabajo se presentan los resultados de un análisis de amplificación génica y de sensibilidad a fármacos antineoplásicos, realizado para un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar. Para los ensayos de quimiosensibilidad las células fueron tratadas durante 48 h con concentraciones variables de taxol, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluoracilo. La citotoxicidad de los fármacos se cuantificó usando el ensayo de reducción de resazurina y se reportó en valores de concentración inhibitoria 50 (CI50). Para los análisis de amplificación génica se emplearon sondas TaqMan® dirigidas contra los genes AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, c-REL y genes de la familia MYC. El número de copias para cada gen fue calculado usando el método de doble delta Ct, empleando ACTB como gen de referencia y la línea MRC-5 como muestra control. Los resultados mostraron que la viabilidad de todas las líneas celulares se afectó por el tratamiento con taxol, cisplatino y doxorrubicina, pero no con el tratamiento con 5-fluoracilo. Las CI50 calculadas se ubicaron entre 0,38 ± 0,03 µM y 111,3 ± 3,58 µM, siendo el taxol y la doxorrubicina los fármacos más potentes. Del panel evaluado las células NCI-H292 resultaron ser las más sensibles y las células LSPG8G las más resistentes a los fármacos. Interesantemente en las células NCI-H292 ningún gen se encontró amplificado; por el contrario en las células LSPG8G los genes cMYC, MYCN, MYCL y AKT2 mostraron un aumento en el número de copias con respecto al de las células control. Estos resultados sugieren que eventos de amplificación génica podrían contribuir con el fenómeno de quimioresistencia en líneas celulares de cáncer de pulmón, sin embargo otros estudios deben realizarse para confirmar esta hipótesis.

In this paper, we show results of anticancer drug sensitivity assays and studies of gen amplification performed for a panel of lung cancer cell lines. For the chemosensitivity assays the cells were treated for 48 h with different concentrations of taxol, cisplatin, doxorubicin and 5-fluorouracil. The cytotoxic effect of each drug was determined using the resazurin reduction assay and reported in terms of inhibitory concentration 50 (IC50). For the analysis of gene amplification we used TaqMan® probes designed against AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, REL and MYC family members. Copy number for each gene was calculated using the delta-delta-CT method, employing ACTB as reference gen and MRC-5 cell line as control sample. In the chemosensitivity assays, we observed a clear decrease in cell viability in the cells treated with taxol, cisplatin and doxorubicin but not in the cells treated with 5-fluorouracil. IC50 values ranging between 0,38± 0,03 µM and 111,3 ±3,58 µM, being the taxol and doxorubicin the most potent drugs. NCI-H292 cell line was the most sensitivity and LSPG8G cell line was the most resistant. Interestingly, NCI-H292 cells did not show increase in the copy numbers for the gene evaluated, in contrast, we observed changes in the gene dosage for cMYC, MYCN, MYCL and AKT2 in LSPG8G cells. These results suggest that gene amplification could contribute to drug resistance in lung cancer cell lines; however, more studies are needed to confirm this hypothesis.

Development and validation of a TaqMan multiplex PCR assay for the Gene Dosage Quantification in cancer / Desarrollo y validación de PCR múltiplex con sondas TaqMan para la cuantificación de la dosis génica en cáncer

Gene dosage tests are very important for the molecular diagnosis of diseases caused by either deletion or amplification of a specific DNA region containing certain genes. Changes in gene copy number may lead to under- or over expression of genes responsible for the disease phenotype. Discovering these defects and understanding their biological meaning can lead to improved therapeutic opportunities in cancer. Fluorescent in situ hybridization (FISH) still remains the gold standard method for gene dosage analysis. However have several limitations since locus specific probes are expensive, the procedure is significantly time-consuming and tandem microduplications may be undetected as a result of the limited resolution on metaphase spreads. Quantitative Real-time PCR is a rapid assay with results available in 24h, has advantages in terms of sensitivity and specificity. In the present study, we have developed an assay using TaqManTM multiplex Real-time PCR for gene dosage analysis of oncogenes EGFR, ERBB2, AKT2, CMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA and REL in human cell lines. This method calculates the copy number of each oncogen and is a promising alternative technique to FISH and Southern blot. Therefore, this technique could be considered as a powerful method gene dosage quantitation in clinical and research genetic surveys.

La evaluación de la dosis génica constituye una herramienta importante para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas tanto por la pérdida o amplificación de una región específica de ADN. El cambio en el número de copias génicas, puede conllevar a la pérdida o sobreexpresión de los genes responsables de fenotipo de la enfermedad. El descubrimiento de estas alteraciones y la comprensión de su significado biológico pueden conducir al incremento de las oportunidades terapéuticas en cáncer. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es el método de referencia para el análisis de la dosis génica “amplificación”. Sin embargo, presenta algunas limitaciones relacionadas con el costo de las sondas locus específicas; el procedimiento es demorado y las microduplicaciones en tándem podrían no ser detectadas como resultado de la limitada resolución de las metafases. En este sentido, la PCR cuantitativa es una metodología rápida y tiene ventajas en términos de sensibilidad y especificidad. En el presente estudio, se estandarizó la PCR multiplex en tiempo real para el análisis de la dosis génica de los oncogenes EGFR, ErbB2, AKT2, cMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA y REL en líneas celulares tumorales humanas, como una técnica alternativa al FISH para evaluar la dosis génica en muestras clínicas de cáncer.

Oncogene amplification as tumor marker in a group of Colombian lung cancer patients / Amplificación oncogénica como marcador tumoral en un grupo de pacientes con cáncer pulmonar

Introduction: In spite of recent treatment advances, lung cancer continues to be the first world cancer related death cause; its mortality associated occupied the fifth place in Colombia in 2004. Complete surgical resection is the therapeutic option with the greatest cure probability, however it results frequently ineffective given the current incapacity in Colombia to an early detection of the disease. This study reports the characterization of a group of 30 lung cancer patients regarding the gene dose (gene copy number) found at the loci corresponding to genes EGFR (erb B1), PIK3CA and C-myc in tumor samples, and compares the results with the dose found in adjacent lung from the same patients. Methods: The gene dose of EGFR (erbB1), PIK3CA, and C-myc were measured by real time PCR in matched tumor and normal lung tissue samples. Results are expressed as the multiplicity of each gene dose with respect to a single copy reference gene. In this case the gene HHB (human hemoglobin). Antiquity of the cases ranged from 5 to 10 years. Results: An increased gene dose for EGFR and PIK3CA was a feature clearly associated to the tumor phenotype of the sample (found in 96 and 100% of the tumors respectively). Quantitative measure of this feature demonstrated for both genes a high sensitivity and specificity for tumor/normal discrimination as confirmed by the ROC analysis. On the other hand, the Spearman test showed a great correlation between EGFR and PIK3CA doses (r=0.75). C-myc was the gene whose dose was less consistently correlated to the tumor phenotype, however most of the patients with amplified C-myc presented distant spread of tumor cells (metastasis) at diagnosis. Conclusion: Quantitative measurement of EGFR, PIK3CA, and C-myc gene dose by real time PCR provides a method for tumor phenotype recognition in DNA samples from lung tissue.

Introducción: A pesar de los avances terapéuticos actuales, el cáncer de pulmón sigue como la primera causa de muerte por cáncer en el mundo, ocupando Colombia el quinto lugar en mortalidad por este tipo de afección en el 2004. La resección quirúrgica total es la alternativa terapéutica con mayores probabilidades de curaciones, pero resulta poco efectiva en el país por la incapacidad actual para detectar tempranamente la enfermedad. Este trabajo informa la caracterización de un grupo de 30 pacientes con cáncer de pulmón con referencia a la dosis génica hallada en los loci correspondientes a los genes EGFR (erb B1), PIK3CA y C-myc en muestras tumorales, comparada con la dosis encontrada en el tejido normal adyacente de los mismos enfermos. Métodos: La dosis génica se midió en cada caso por PCR en tiempo real sobre ADN aislado de tejido tumoral y normal preservado en parafina de cada paciente. Los resultados se expresan como el número de veces que la dosis de cada gen sobrepasa la dosis de un gen de referencia, en este caso el HHB (hemoglobina humana b). El rango de antigüedad de los casos fue de 5 a 10 años. Resultados: Una dosis génica incrementada para los genes EGFR, PIK3CA demostró ser una característica claramente asociada con el fenotipo tumoral (96% y 100% de los tumores respectivamente). La medición cuantitativa de dicho fenómeno demostró en ambos casos gran sensibilidad y especificidad para la discriminación tumor/normal como lo confirma el análisis ROC. Por otro lado, la amplificación simultánea de ambos genes en el mismo paciente fue un hecho observado con alta frecuencia (Spearman=0.75). La dosis de C-myc mostró una asociación menos consistente con el carácter tumoral, sin embargo todos los pacientes con C-myc amplificado presentaron dispersión distante de células tumorales (metástasis).