Experiencia en el uso de los protocolos Biomed-2 para el estudio de reordenamientos de TCR e inmunoglobulinas en proliferaciones linfoides en el Instituto Nacional de Cancerología, Colombia / Experience with the BIOMED-2 standardized polymerase chain reaction protocol for immunoglobulin and T- cell receptor clonality analysis in the Instituto Nacional de Cancerología, Colombia

Introducción. El consorcio europeo BIOMED-2 se creó para determinar si una población linfoide de difícil clasificación patológica es clonal. En Colombia, la implementación de estas pruebas comenzó en el 2015 en el Instituto Nacional de Cancerología E.S.E. (Bogotá). Objetivos. Determinar el comportamiento de las pruebas de reordenamiento clonal o clonalidad linfoide. y determinar las dificultades de su uso en nuestro medio verificando su adaptación local y los resultados en una serie retrospectiva de casos y consecutiva de proliferaciones linfoides sometidas a los protocolos BIOMED-2. Materiales y métodos. A partir de las historias clínicas, se recolectaron los datos clínicos e histológicos y los resultados de los análisis de los reordenamientos en todos los casos de proliferaciones linfoides sometidas a los protocolos BIOMED-2, entre febrero de 2015 y mayo de 2019. Resultados. Se hallaron 132 casos, de los cuales 47 se clasificaron mediante los protocolos de Biomed-2 como hiperplasias linfoides reactivas, 62 como linfomas T, 19 como linfomas B y 3 como neoplasias linfoides de linaje no establecido. Solo en un caso falló la extracción de ADN. Según estos resultados, la mayor dificultad diagnóstica para el patólogo fue el análisis de los infiltrados linfoides T, la mayoría (44) de los cuales correspondía a lesiones cutáneas. Conclusiones. Las pruebas de clonalidad pueden usarse en tejidos de diversa calidad en nuestro medio como ayuda en el diagnóstico de proliferaciones linfoides de difícil clasificación. Es importante hacerlas e interpretarlas de manera multidisciplinaria y considerar cada caso por separado.

Introduction: The European BIOMED-2 consortium was created to evaluate clonality in lymphoproliferations that are difficult to diagnose. In Colombia, the implementation of these tests began in 2015 at the Instituto Nacional de Cancerología E.S.E., Bogotá. Objectives: To determine the behavior of the rearrangement tests for lymphoid clonality and the difficulties of its implementation in our field through a series of retrospective and consecutive cases of lymphoid proliferation subjected to the BIOMED-2 protocols. Materials and methods: Clinical and histological data and the results of the rearrangement analysis of all cases of lymphoid proliferation subjected to the BIOMED-2 protocols between February 2015 and May 2019 were collected from clinical histories. Results: We recovered 132 samples from which 47 corresponded to reactive lymphoid hyperplasias, 62 to T lymphomas, 19 to B lymphomas, and three to lymphoid neoplasms of unestablished lineage. Only in one case did DNA extraction fail. According to these results, the greatest diagnostic difficulty for the pathologist was the analysis of T lymphoid infiltrates, most of which (44) were skin lesions. Conclusions: Clonality tests can be used in tissues of different quality to help in the diagnosis of lymphoid proliferations that are difficult to classify. It is important to implement and interpret them in an interdisciplinary way considering each case separately.

Distribución y caracterización fenotípica y genotípica de Listeria monocytogenes en aislamientos de alimentos, Colombia, 2010-2018 / Distribution and phenotypic and genotypic characterization of Listeria monocytogenes isolated from food, Colombia, 2010-2018

Resumen | Introducción. Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por alimentos que causa infecciones en humanos, entre ellas, meningitis, meningoencefalitis y septicemias, así como abortos. Con la tipificación serológica se han identificado 13 serotipos, siendo el 4b el causante de la mayoría de los brotes en el mundo. Objetivo. Determinar la frecuencia y la distribución de los serotipos y subtipos moleculares de L. monocytogenes aislados de alimentos en Colombia entre el 2010 y el 2018. Materiales y métodos. Se hizo un estudio descriptivo y retrospectivo a partir del análisis de 2.420 aislamientos que fueron identificados como L. monocytogenes y otras especies, por medio de pruebas bioquímicas, serológicas y de subtipificación molecular mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Resultados. De los 2.420 aislamientos recibidos, 2.326 fueron confirmados como L. monocytogenes. Los serotipos encontrados fueron: 4b (52%), 4d-4e (14,5%), 1/2a (11%), 1/2c (9,4%), 1/2b (9 %), y 3a, 3b, 3c, 4c, 4d, 4e y 7 (menos de 2%). Procedían de Bogotá (43%), Antioquia (25%), Valle (10%), Nariño (9%) y otros departamentos (7%). La caracterización genotípica agrupó los aislamientos evaluados en 167 patrones de PFGE; los perfiles más frecuentes se presentaron en productos lácteos, cárnicos y alimentos preparados. Conclusión. El 96,1 % de los aislamientos correspondieron a L. monocytogenes, con una buena concordancia entre el aislamiento y la identificación; el serotipo 4b, extremadamente virulento, fue el más frecuente. El análisis molecular evidenció la posible diseminación y permanencia en el tiempo de varios serotipos, lo que resalta la importancia de incluir este patógeno en los programas de vigilancia epidemiológica en alimentos.

Abstract | Introduction: Listeria monocytogenes is a food-borne pathogen that may cause infections in humans such as meningitis, meningoencephalitis, and septicemia, as well as abortions. By serological typing 13 serotypes have been identified of which 4b is responsible for most of the outbreaks in the world. Objective: To determine the frequency and distribution of serotypes and molecular subtypes of L. monocytogenes isolated in Colombia from food from 2010 to 2018. Materials and methods: We conducted a retrospective and descriptive study based on the analysis of 2,420 isolates confirmed as L. monocytogenes and other species using biochemical and serological tests, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for molecular subtyping. Results: Of the 2,420 isolates received, 2,326 were confirmed as L. monocytogenes. The serotypes found were 4b (52%), 4d-4e (14.5%), 1/2a (11%), 1/2c (9.4%), 1/2b (9%), and 3a, 3b, 3c, 4c, 4d, 4e and 7 (less than 2%). The isolates came from Bogotá (43%), Antioquia (25%), Valle (10%), Nariño (9%), and other departments (7%). The genotypic characterization grouped the isolates in 167 PFGE patterns. The most frequent patterns were identified in various dairy and meat products, and in prepared foods. Conclusion: A 96.1% of the isolates corresponded to L. monocytogenes showing good agreement between isolates and identification. Serotype 4b, highly virulent, was the most frequent. The molecular analysis showed the possible dissemination and permanence over time of several serotypes, which highlights the importance of including this pathogen in epidemiological food surveillance programs.

Streptococcus pneumoniae serotype 3 genotypes in invasive isolates from Colombia / Genotipos del serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae en aislamientos invasivos en Colombia

Abstract | Introduction: Streptococcus pneumoniae serotype 3 is an important cause of pneumonia, bacteremia, and meningitis. Objective: To establish the circulating genotypes of S. pneumoniae serotype 3 isolates recovered from the invasive disease between 1994 to 2015 in Colombia. Materials and methods: Of the 365 S. pneumoniae serotype 3 isolates recovered through the laboratory national surveillance program, 117 isolates were analyzed. Pulsed-field gel electrophoresis was used for genotyping, and multilocus sequence typing was determined in representative isolates. Results: The frequency of this serotype increased from 2.7% between 1994 and 1998 to 9.1% between 2011 and 2015 (p=0.000); 91.7% of the isolates showed a genetic similarity greater than 77% and were related to the Netherlands3-31(PMEN31) clone CC180. Several subtypes were identified, two of which showed antimicrobial resistance. Conclusion: In Colombia, the pneumococcal population of the capsular type 3 shows a continuous and homogeneous circulation relating to the clonal group ST-180.

Resumen | Introducción. El serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae es una causa importante de neumonía, bacteriemia y meningitis. Objetivo. Establecer los genotipos circulantes de aislamientos del serotipo 3 de S. pneumoniae recuperados de muestras de enfermedad invasiva de 1994 a 2015 en Colombia. Materiales y métodos. Se analizaron 117 de los 365 aislamientos del serotipo 3 de S. pneumoniae recuperados del programa nacional de vigilancia por el laboratorio. El genotipo se estableció con electroforesis en gel de campo pulsado y la tipificación se llevó a cabo mediante secuenciación multilocus en aislamientos representativos. Resultados. La frecuencia de este serotipo aumentó de 2,7 % entre 1994 y 1998 a 9,1 % entre 2011 y 2015 (p=0,000). El 91,7 % de los aislamientos evidenció una similitud genética superior al 77 % y se relacionó con el clon CC180 de Netherlands3-31 (PMEN31). Se identificaron varios subtipos, dos de los cuales mostraron resistencia a los antimicrobianos. Conclusión. En Colombia, la población neumocócica del tipo capsular 3 tiene una circulación continua y homogénea relacionada con el grupo clonal ST-180.

Efecto citotóxico y genotóxico in vitro del extracto crudo y etanólico del rizoma de Curcuma longa L / In vitro cytotoxic and genotoxic effect of the crude and ethanolic extract from the rhizome of Curcuma longa L

RESUMEN Objetivos: Determinar el efecto citotóxico y genotóxico in vitro del extracto crudo y etanólico del rizoma de Curcuma longa L. Materiales y métodos: El efecto citotóxico fue evaluado utilizando líneas celulares DU-145, HT-29, 3T3 BALB/c. Se hallaron los porcentajes de crecimiento en 48 horas y se determinó la concentración inhibitoria 50 (CI50). El efecto genotóxico en el ADN genómico humano se determinó mediante el método Tomasevich. Resultados: El extracto crudo produjo una CI50 de 12,98 ± 0,21 μg/mL para la línea celular tumoral HT-29, que es inferior a DU-145 con una CI50 de 36,77 ± 9,12 μg/mL; el extracto etanólico presentó una CI50 de 13,24 ± 0,77 y 20,54 ± 2,58 µg/mL para ambas líneas celulares, respectivamente; el compuesto estándar curcumina presentó una CI50 de 3,96 ± 0,60 y 13,94 ± 2,79 μg/mL, respectivamente. El extracto crudo a concentraciones de 50 y 100 mg/mL fragmentó entre el 40% a 95% de ADN genómico humano; mientras que, a 200 mg/mL, la fragmentación fue mayor al 95%. El extracto etanólico a todas las concentraciones no fragmentó el ADN. La curcumina a 200 mg/mL fragmentó menos del 5% de ADN genómico humano. Conclusiones: Los extractos crudo y etanólico de Curcuma longa L. demuestran efecto citotóxico in vitro diferencial para la línea celular tumoral humana DU-145 y HT29 semejante al compuesto estándar curcumina. El extracto crudo de Curcuma longa L. presenta una potente actividad genotóxica in vitro frente al ADN genómico humano, esta actividad está ausente en el extracto etanólico.

ABSTRACT Objectives: To determine the in vitro cytotoxic and genotoxic effect of the crude and ethanolic extract from the Curcuma longa L. rhizome. Materials and methods: The cytotoxic effect was evaluated using DU-145, HT-29, 3T3 BALB/c cell lines. The growth percentages in 48 hours; and the half maximal inhibitory concentration (IC50) were determined. The genotoxic effect on human genomic DNA was determined using the Tomasevich method. Results: Crude extract produced an IC50 of 12.98 ± 0.21 μg/mL for the HT-29 tumor cell line, which is lower than the value obtained for DU-145, with an IC50 of 36.77 ± 9.12 μg/mL. The ethanolic extract presented an IC50 of 13.24 ± 0.77 and 20.54 ± 2.58 μg/mL for both cell lines, respectively; the curcumin standard compound presented an IC50 of 3.96 ± 0.60 and 13.94 ± 2.79 μg/mL, respectively. Crude extract concentrations of 50 and 100 mg/mL fragmented between 40% to 95% of human genomic DNA; while at 200 mg/mL, fragmentation was greater than 95%. The ethanolic extract at all concentrations did not fragment the DNA. Curcumin at 200 mg/mL fragmented less than 5% of human genomic DNA. Conclusions: The crude and ethanolic extracts of Curcuma longa L. demonstrate different in vitro cytotoxic effects for the human tumor cell lines DU-145 and HT-29; similar to the standard curcumin compound. The crude extract of Curcuma longa L. shows a potent genotoxic in vitro activity against human genomic DNA; this type of effect is not produced by the ethanolic extract.

Los patrones electroforéticos de proteínas salivales permiten diferenciar los grupos transandino y cisandino de las especies de Rhodnius de Colombia / Salivary proteins electrophoretic patterns enabled differentiating Colombian Rhodnius Trans-Andean and Cis-Andean groups

Introducción. Las especies Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) están conformadas por insectos hematófagos vectores de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, y T. rangeli, parásito infectivo pero no patógeno para el vertebrado. El estudio de la diversidad proteica de la saliva de estos insectos permite la obtención de perfiles electroforéticos unidimensionales característicos de algunas especies de triatominos. Sin embargo, el reporte de los patrones electroforéticos de proteínas salivales de las especies de Rhodnius ha sido escaso. Objetivo. Hacer un análisis comparativo de los perfiles electroforéticos unidimensionales de las proteínas salivales de R. colombiensis, R. pallescens, R. pictipes, R. prolixus y R. robustus. Materiales y métodos. Se obtuvieron los perfiles electroforéticos de la saliva de las especies en estudio mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) y se construyó un fenograma mediante el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages). Resultados. Los perfiles electroforéticos de las proteínas solubles de saliva presentaron bandas en un rango de masa aproximado de 15 a 45 kDa, los cuales permitieron diferenciar las cinco especies estudiadas. El fenograma reveló la existencia de dos grupos principales: uno conformado por los grupos cisandinos Pictipes y Prolixus y otro constituido por el grupo transandino Pallescens. Conclusiones. Existen diferencias en los perfiles electroforéticos de las proteínas salivales entre R. colombiensis, R. pallescens, R. pictipes, R. prolixus y R. robustus, cuya variabilidad permitió construir un fenograma congruente con los grupos del género Rhodnius.

Introduction: Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) species are made up of haematophagous insect vectors for Trypanosoma cruzi (Chagas' disease aetiological agent) and T. rangeli, an infective parasite that is not pathogenic for vertebrate hosts. The study of their salivary protein diversity enables the obtention of characteristic one-dimensional electrophoretic profiles of some triatomine species; however, few reports have dealt with Rhodnius species salivary proteins electrophoretic patterns. Objective: To compare R. colombiensis, R. pallescens, R. pictipes, R. prolixus, and R. robustus' salivary proteins one-dimensional electrophoretic profiles. Materials and methods: SDS-PAGE was used for obtaining electrophoretic profiles of saliva from the species under study. The unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) was used for constructing a phenogram. Results: Electrophoretic profiles of soluble saliva had protein bands ranging from 15 to 45 kDa, thereby enabling the five species studied to be differentiated. The phenogram revealed two main groups, one formed by the Pictipes and Prolixus cis-Andean groups and another consisting of the Pallescens trans-Andean group. Conclusion: Differences were revealed regarding R. colombiensis, R. pallescens, R. pictipes, R. prolixus, and R. robustus electrophoretic profiles of salivary proteins; their variability facilitated constructing a phenogram which was taxonomically congruent with the groups from the genus Rhodnius.

Diversity and abundance of denitrifiers during cow manure composting / Diversidad y abundancia de desnitrificadores durante el compostaje del estiércol de vaca

Diversity and abundance of the denitrifying genes nirK, nirS and nosZ were investigated in cow manure compost using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) and real-time quantitative PCR (qPCR), respectively. These three genes were detected in all the stages of the composting process. Phylogenetic analysis showed that the nirK gene was closely related to Rhizobiales, Burkholderiales, the nirS gene was closely related to Pseudomonadales and Burkholderiales, and the nosZ gene was closely related to Rhodospirillales, Rhizobiales, Pseudomonadales, and Alteromonadales. qPCR results showed that the abundance of these three genes (nirK, nirS and nosZ) reached the peak value in the late thermophilic stage of composting and abundance of the nirK gene was higher than that of the nosZ gene and the nirS gene. Redundancy analysis (RDA) showed that the diversity of the nirK and nirS genes was significantly correlated with ammonium (p < 0.05), the diversity of the nosZ gene was significantly correlated with pH (p < 0.05) and the abundance of the nirK nirS and nosZ genes was significantly correlated with temperature (p< 0.05).

La diversidad y la abundancia de los genes desnitrificadores nirK, nirS, nosZ en el compost de estiércol de vaca se investigaron por medio de la reacción en cadena de la polimerasa seguida de electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (PCR-DGGE) y por PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real, respectivamente. Estos 3 genes fueron detectados durante todas las fases del compostaje. El análisis filogenético mostró estrecha relación del gen nirK con Rhizobiales y Burkholderiales, del gen nirS con Pseudomonadales y Burkholderiales y del gen nosZ con Rhodospirillales, Rhizobiales, Pseudomonadales y Alteromonadales. Los resultados de la qPCR mostraron que la abundancia de los genes nirK, nirSy nosZ alcanzó el valor máximo en la fase termofílica tardía del compostaje, y que la abundancia del gen nirK era más elevada que los de los genes nosZ y nirS. El análisis de redundancia (RDA) mostró que la diversidad de los genes nirK y nirS estaba significativamente correlacionada con la concentración de amonio (p<0,05), mientras que la del gen nosZ estaba significativamente correlacionada con el pH (p<0,05). También mostró que la abundancia de los genes nirK, nirS y nosZ estaba significativamente correlacionada con la temperatura (p<0,05).

Bifidobacterias como indicadoras de contaminación fecal en aguas tropicales

La contaminación fecal humana en el agua constituye un importante riesgo para la salud pública, sin embargo, los microorganismos indicadores comúnmente utilizados para detectar contaminación fecal no identifican su fuente específica. La detección de ciertas especies del género Bifidobacterium como B. adolescentis y B. dentium ha sido propuesta como un efectivo marcador de contaminación fecal humana, pero esto no ha sido evaluado en las condiciones ambientales tropicales. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de bifidobacterias, en una muestra de agua de la Ciénaga de Mesolandia en el Caribe Colombiano y en 260 muestras fecales humanas y 94 de animales domésticos de un asentamiento humano periférico a la ciénaga. El ADN extraído de cada una de las muestras fue amplificado por PCR mediante el uso de cebadores específicos de género basados en la secuencia del gen 16S ARNr y separados por DGGE (Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante). Las bandas obtenidas en DGGE, fueron extraídas del gel, re-amplificadas, secuenciadas y las secuencias comparadas con la base de datos del GenBank. El perfil de bifidobacterias en DGGE mostró la presencia de ocho especies de Bifidobacterias en la muestra de agua, las cuales también fueron identificadas en las heces humanas. B. adolescentis y B. dentium propuestas como marcadores de contaminación fecal humana, también fueron encontradas en animales domésticos. En este estudio bajo las condiciones ambientales y experimentales evaluadas no fue posible encontrar una especie de Bifidobacteria específica para ser utilizada como marcador de contaminación fecal humana en ambientes tropicales. Sin embargo, el método aplicado permitió una aproximación más cercana al origen de la contaminación fecal en relación con los métodos culturales tradicionales, ya que fue posible encontrar secuencias de ADN idénticas en el agua y en las muestras fecales.

Human fecal pollution in water constitute a serious risk to the public health, nevertheless the indicator microorganisms commonly used to detect the levels of fecal pollution does not identify the specific source. The detection of certain Bifidobacterium species as B. adolescentis and B. dentium have been proposed as an effective marker of human fecal contamination, but this has not yet been demonstrated in tropical environmental conditions. The aim of the present work was to determine the Bifidobacteria profile in one sample of water from the Mesolandia Swamp in the Colombian Caribbean and feces samples of 260 human and 94 domestic animals from a human settlement around the swamp. DNA from all the samples was amplified by PCR using specific specie primers based on the 16S rRNA gene sequence and separated by DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). DGGE bands were excised, reamplified, sequenced, and compared to GenBank database. Bifidobacterial DGGE profiles showed that eight species of Bifidobacterium that were found in the water sample, were also present in the human and animal feces. Bifidobacterium adolescentis and B. dentium described as potential human fecal pollution indicators were found in domestic animals. In this study under the environmental and experimental conditions evaluated was not possible to find a Bifidobacterium species as specific marker of human fecal contamination in tropical areas. However, the applied method in this study could be useful to detect fecal pollution in tropical waters allowing a nearest approximation to the origin of the fecal pollution compared with cultural traditional methods, since it was possible to find identical DNA sequences in the water and in the fecal samples.

Molecular characterization of non-vaccine Streptococcus pneumoniae serotypes 11A, 15 B/C and 23A recovered from invasive isolates in Colombia / Caracterización molecular de los serotipos no vacunales 11A, 15 B/C y 23A de Streptococcus pneumoniae recuperados de aislamientos invasivos en Colombia

Resumen Introduction: A total of 192 invasive Streptococcus pneumoniae isolates, from serotypes 11A, 15B/C and 23A (not included in the conjugated vaccines), were collected in Colombia between 1994 and 2014 as part of the activities of the Network surveillance system for the causative agents of pneumonia and meningitis (SIREVA II). Objective: To determine the molecular characteristics ofinvasive S. pneumoniaeisolates from serotypes 11A, 15B/C and 23A in Colombia from 1994 to 2014. Materials and methods: The molecular characterization of the isolates was carried out through Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Multilocus Sequence Typing (MLST). Results: Serotype 11A showed one clonal group represented by ST62. Serotype 15B/C was composed of three groups associated with Netherlands15B-37 ST199 (28.75%), ST8495 (18.75%), and SLV (Single-Locus Variant) of ST193 (21.25%). Isolates from serotype 23A were gathered in three clonal groups, with70.21% closely related toST42, 17.02% to Colombia23F-ST338, and6.38% to Netherlands15B-37 ST199. Conclusion: Clones Colombia23F-ST338 andNetherlands15B-ST199 covered more serotypes than those previously found by other authors, including serotype 23A. These analyses reveal the importance of capsular switching in the spreading of successful clones among non-vaccine serotypes causing invasive pneumococcal disease.

Abstract Introducción. En Colombia se recolectaron 192 aislamientos invasivos de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 11A, 15B/C y 23A (no incluidos en las vacunas conjugadas) entre 1994 y 2014, como parte de las actividades del Sistema de Redes de Vigilancia de los Agentes Responsables de Neumonías y MeningitisBacterianas (SIREVA II). Objetivo. Determinar las características moleculares de aislamientosinvasivos de los serotipos11A, 15B/C y 23A de S. pneumoniae recolectados en Colombia entre 1994 y 2014. Materiales y métodos. La caracterización molecular de los aislamientos se hizo medianteelectroforesis en gel de campo pulsado (Pulse-Field Gel Electrophoresis, PFGE) y por tipificación de secuencias multilocus (Multilocus Sequence Typing, MLST). Resultados. El serotipo 11A mostró un grupo clonal representadopor el ST62, en tanto que el serotipo15B/C se distribuyó en tres grupos asociados conlos clones Netherlands15B-37 ST199 (28,75 %), ST8495 (18,75 %) y SLV (variante en un solo locus) de ST193 (21,25 %). Los aislamientos con serotipo 23A se agruparon en tres gruposclonales; 70,21 % de ellos estaban estrechamente relacionadoscon elST42, 17,02 % con elColombia23F-ST338, y 6,38 % con el Netherlands15B-37 ST199. Conclusión. Los clones Colombia23F-ST338 y Netherlands15B-ST199 encontrados en este estudio abarcaronmás serotipos de los reportados previamente por otros autores, incluido el serotipo23A. Estos análisis revelan laimportancia de la conmutación(switching) capsular en la expansión de clones exitosos entre los serotipos no vacunales como causa de enfermedad invasiva neumocócica.

Presencia de estafilococos coagulasa positiva ambientales, su relación clonal, factores de resistencia y habilidad para formar biopelícula / Presence of environmental coagulase-positive staphylococci, their clonal relationship, resistance factors and ability to form biofilm

Coagulase-positive staphylococci (CoPS) are opportunistic pathogens carrying various mechanisms of resistance that have a large number of virulence factors, and whose ability to induce illness is associated with the host. This study aimed to investigate the presence of environmental coagulase-positive staphylococci, their susceptibility profile, clonal relationship and ability to form biofilm. The 16S rRNA genes from CoPS isolates were analyzed, and their antibiotic susceptibility was evaluated using the agar dilution method in accordance with Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines. The clonal profile was obtained by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and biofilm formation was measured by a crystal violet retention assay. A total of 72 Staphylococcus spp. strains were isolated from air, metal surfaces, and nostrils from humans, dogs, cats, and birds. Three species were identified: Staphylococcus aureus (17%), Staphylococcus intermedius (63%), and Staphylococcus pseudintermedius (21%). Ninety three percent (93%) of the strains were resistant to at least one of 13 tested antibiotics. S. pseudintermedius strains were the only resistant ones to methicillin while most of these isolates were multidrug-resistant, had significantly higher ability to form biofilm and PFGE grouped into seven different patterns, without showing clonal dispersion among animals and environmental isolates. This study suggests that dogs, cat, and air are environmental sources potentially carrying multidrug-resistant S. pseudintermedius, which survives in different environments through biofilm formation and multidrug resistance, characteristics that can be transmitted horizontally to other bacteria and exacerbate the problem of antibiotic resistance in humans.

Los estafilococos coagulasa-positiva (CoPS) son patógenos oportunistas, portan varios mecanismos de resistencia, tienen un gran número de factores de virulencia y su capacidad para inducir la enfermedad está asociada con el hospedero. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de CoPS en el medio ambiente, su perfil de sensibilidad a los antibióticos, su relación clonal y su capacidad para formar biopelícula. De los aislamientos de CoPS se analizaron los genes 16S ARNr y se evaluó la sensibilidad a los antibióticos mediante el método de dilución en agar según el CLSI. El perfil clonal se obtuvo por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y la formación de biopelícula se analizó por retención de cristal violeta. Se aislaron 72 cepas de Staphylococcus spp. a partir de aire, superficies metálicas y narinas de humanos, perros, gatos y aves. Se identificaron tres especies: Staphylococcus aureus (17%), Staphylococcus intermedius (62%) y Staphylococcus pseudintermedius (21%). El 93% de las cepas fueron resistentes al menos a uno de 13 antibióticos probados. Los aislamientos de S. pseudintermedius fueron los únicos resistentes a meticilina y la mayoría fueron resistentes a múltiples fármcos, tuvieron una capacidad significativamente mayor para producir biopelícula y la PFGE los agrupó en 7 diferentes patrones, sin mostrar dispersión clonal entre los aislamientos de animales y de medio ambiente. Este estudio sugiere que los perros, los gatos y el aire son fuentes ambientales potencialmente portadoras de S. pseudintermedius resistente a múltiples antibióticos. Este agente sobrevive en diferentes entornos en virtud de la formación de biopelículas y la resistencia a múltiples antibióticos, características que pueden transmitirse horizontalmente a otras bacterias y, por ende, exacerbar el problema de la resistencia a los antibióticos en humanos.

Análisis proteómico del veneno de la abeja africanizada: comparación de métodos de extracción / Proteomic Analysis of Africanized Bee Venom: a Comparison of Protein Extraction Methods

La abeja africanizada es la más común en la apicultura colombiana y a su veneno (apitoxina) se le han atribuido propiedades terapéuticas para diferentes enfermedades, sin mayor soporte científico. Al revisar en la literatura los reportes publicados sobre el análisis proteómico de la apitoxina, se encontraron cuatro métodos distintos para la extracción de proteínas de la apitoxina. El primer método consiste en resuspender la apitoxina en Urea 7 M, precipitar con acetona y finalmente resuspender en Urea 7 M y CHAPS 4 %. Para el segundo método se resuspende la apitoxina en buffer de lisis, se precipita con ácido tricloroacético, y luego se resuspende en Urea 7 M y CHAPS 4 %. El tercer método es igual al anterior, excepto que la precipitación se realiza con acetona en vez de ácido tricloroacético. Finalmente, el cuarto método consiste en resuspender la apitoxina en agua destilada, precipitar con acetona y resuspender en Urea 7 M y CHAPS 4 %. Este trabajo se enfocó en comparar el desempeño de estos cuatro métodos de extracción y determinar el método con el mejor resultado en cuanto a la concentración e integridad obtenida de las proteínas. De los distintos métodos evaluados, se encontró que los mejores resultados en cuanto a concentración de proteínas se obtuvieron con la resuspensión de apitoxina en buffer de lisis y precipitación con acetona (método 3) y con el método de resuspensión de apitoxina en agua destilada y precipitación con acetona (método 4). De estos, el mejor método de extracción en cuanto a integridad de las proteínas y perfil proteómico fue el de resuspensión de apitoxina en buffer de lisis seguido de precipitación con acetona (método 3).

The Africanised bee is the most common type of bee in Colombia, and therapeutic properties for different diseases have been attributed to its venom, without much scientific support. A literature search of reports on the proteomic analysis of honeybee venom yielded four different methods for extracting proteins from bee venom. The first method consists in resuspending the venom in 7 M Urea, followed by precipitation with acetone and finally resuspending the pellet in 7 M Urea and 4 % CHAPS. For the second method, the venom is resuspended in lysis buffer, precipitated with trichloroacetic acid, and then resuspended in 7 M Urea and 4 % CHAPS. The third method is similar to the previous one, except that the precipitation step is performed with acetone instead of trichloroacetic acid. Finally, the fourth method is to resuspend the venom in distilled water, precipitate with acetone and resuspend in 7 M Urea and 4 % CHAPS. This work focused on comparing the performance of these four extraction methods, in order to determine the method with the best results in terms of concentration and integrity of the proteins obtained. Of the four methods evaluated, the best results in terms of protein concentration and yield were obtained by resuspending the bee venom in lysis buffer followed by precipitation with acetone (method 3), and by resuspending in distilled water followed by precipitation with acetone (method 4). Of these, the method that maintained protein integrity and yielded the best proteomic profile was that in which the bee venom was resuspended in lysis buffer followed by precipitation with acetone (method 3).

Caracterización molecular de aislamientos de Shigella sonnei recuperados en el programa de vigilancia por el laboratorio de la enfermedad diarreica aguda en Colombia / Molecular characterization of Shigella sonnei isolates recovered by the Laboratory Surveillance Program for Acute Diarrheal Disease in Colombia

Introducción. En Colombia, Shigella sonnei es uno de los serotipos más frecuentemente aislados (53,4 %) de muestras clínicas humanas asociadas a la enfermedad diarreica aguda. La identificación de patrones de restricción del ADN mediante electroforesis en gel de campo pulsado constituye la base de la vigilancia molecular de S. sonnei . Objetivo. Establecer la base de la vigilancia molecular de S. sonnei en Colombia mediante electroforesis en gel de campo pulsado. Materiales y métodos. Se estudiaron 102 de los 2.048 aislamientos de S. sonnei remitidos por la Red Nacional de Laboratorios entre 1997 y marzo del 2013; la selección se hizo de acuerdo con el patrón de resistencia antimicrobiana, el origen de la muestra y la relación con brotes. Se determinó el patrón genético mediante electroforesis en gel de campo pulsado con las enzimas de restricción XbaI y Blnl, según el protocolo de la red PulseNet International. El análisis de los patrones electroforéticos se hizo con el programa GelCompar II, versión 4.0. Resultados. Se obtuvieron 42 patrones electroforéticos con una similitud de 70 a 100 %. El patrón más frecuente fue COIN08J16X01.0017 (17,6 %), seguido por los patrones COIN04J16X01.0004 (9,8 %) y COIN02J16X01.0002 (5,8 %), y el 66,8 % restante se asoció con otros patrones electroforéticos. El análisis de brotes demostró la relación genética de cada brote con 100 % de similitud en la identificación; el patrón más frecuente en los brotes fue el COIN08J16X01.0017 (17,1 %). Conclusión. Se estableció la base de datos genotípicos de aislamientos de S. sonnei a nivel nacional mediante electroforesis en gel de campo pulsado; se incluyeron los 42 patrones únicos identificados en este estudio.

Introduction: In Colombia, Shigella sonnei is one of the most frequently isolated serotypes (53.4%) in human clinical samples associated with diarrheal acute disease. The identification of DNA restriction patterns by pulsed field gel electrophoresis is the basis for the molecular surveillance of S. sonnei . Objective: To establish the basis for the molecular surveillance of S. sonnei in Colombia using pulsed-field gel electrophoresis. Materials and methods: We studied 102 of 2,048 S. sonnei isolates referred by the National Laboratory Network between 1997 and March, 2013; the selection was made according to the antimicrobial multiresistance profile, the source of samples, and the relation to outbreaks. The genetic profile was determined by pulsed field gel electrophoresis using the restriction enzymes XbaI and BlnI in accordance with the PulseNet International protocol. The electrophoretic patterns were analyzed with the GelCompare II, version 4.0 software. Results: We obtained 42 electrophoretic patterns with a 70% to 100% similarity. The most frequent pattern was COIN08J16X01.0017 with 17.6%, followed by patterns COIN04J16X01.0004 with 9.8%, and COIN02J16X01.0002 with 5.8%, while the remaining 66.8% was associated with other electrophoretic patterns. The analysis of 10 outbreaks demonstrated their genetic relation with a 100% of similarity; the most frequent pattern in outbreaks was COIN08J16X01.0017 with 17.1%. Conclusion: The genotypic database for Shigella sonnei isolates was established using pulsed field gel electrophoresis including the 42 unique patterns identified in this study.

Daño basal del ADN en un grupo de individuos cubanos sanos mediante ensayo Cometa alcalino / Basal DNA damage on a group of Cuban healthy individuals by alkaline Comet assay / Dano basal no DNA em um grupo de indivíduos cubanos saudáveis através do ensaio Cometa alcalino

El ADN de las células humanas está sujeto de forma constante a diferentes tipos de daños debido a factores ambientales y a procesos metabólicos propios de la célula, que de no ser reparados y renovada su integridad, provocan inestabilidad genómica. Consecuentemente el daño en el ADN ha sido utilizado como marcador biológico en el biomonitoreo humano. El objetivo del presente trabajo fue determinar el daño basal del ADN en linfocitos aislados de sangre periférica de individuos voluntarios sanos, sin antecedentes patológicos y/o exposición a agentes genotóxicos. Se incluyó un total de 95 sujetos residentes en La Habana, con una edad promedio de 34±12 años, en los que el 71,13% correspondió a mujeres. Se empleó la variante alcalina del ensayo Cometa. Los niveles de daño fueron determinados en unidades arbitrarias. El daño basal del ADN, cuantificado en los 95 individuos, fue de 34,98±19,6 UA (25%=20,5 UA, 75%=47,5 UA). Los valores determinados constituyen los valores de referencia del laboratorio para el daño basal del ADN, en sujetos sanos. El punto de corte de daño al ADN, correspondiente al percentil 75, presenta aplicabilidad en el estudio de pacientes e individuos expuestos a xenobióticos. El uso de este valor permite la realización de estrategias de intervención oportunas que contribuyan a reparar tempranamente el daño detectado.

Human cell DNA is constantly subject to different types of damage due to environmental factors and metabolic processes of the same cell, which cause genomic instability if not repaired and completely renewed. Consequently, DNA damage has been used as a biomarker in human biomonitoring. The aim of this study was to determine basal DNA damage in lymphocytes isolated from peripheral blood of healthy volunteers with no medical history and/or exposure to genotoxic agents. A total of 95 subjects from the western region of Cuba, with an average age of 34±12 years, 71.13% of whom were female were included. Alkaline Comet assay variant was used. Damage levels were determined in arbitrary units. Basal DNA damage, measured in 95 subjects, was 34.98 ± 19.6 AU (25% = 20.5 AU, 75% = 47.5 AU). The values determined are the laboratory reference values for basal DNA damage in healthy subjects. The cutoff of DNA damage, corresponding to 75 percentile, has applicability in the study of patients and subjects exposed to xenobiotics. Use of this value allows for the realization of appropriate intervention strategies that help early repair of the damage detected.

O DNA das células humanas está constantemente sujeito a diferentes tipos de danos devido a fatores ambientais e a processos metabólicos próprios da célula, que se não forem reparados e a sua integridade renovada, provocam instabilidade genômica. Por conseguinte, o dano no DNA foi utilizado como um biomarcador no biomonitoramento humano. O objetivo deste estudo foi determinar o dano basal do DNA em linfócitos isolados de sangue periférico de voluntários saudáveis, sem antecedentes patológicos e/ou exposição a agentes genotóxicos. Um total de 95 indivíduos residentes em Havana foram incluídos, com uma idade em média de 34±12 dos quais 71,13% eram mulheres. Foi utilizada a variante alcalina do ensaio Cometa. Os níveis de dano foram determinados em unidades arbitrárias. O dano basal do DNA, medido nos 95 pacientes, foi de 34,98 ± 19,6 UA (25% = 20,5 UA, 75%=47,5 UA). Os valores determinados são os valores de referência do laboratório para o dano basal do DNA em indivíduos saudáveis. O ponto de corte de dano ao DNA, correspondente ao 75 percentil, tem aplicabilidade no estudo de pacientes e indivíduos expostos a xenobióticos. O uso deste valor permite a realização de estratégias de intervenção adequadas que ajudem a reparar precocemente o dano detectado.

Fenotipo de la reparación por escisión de nucleótidos en pacientes cubanos con hipersensibilidad al sol / Phenotype of the nucleotide excision repair in Cuban sun-hypersensitive patients

INTRODUCCIÓN: deficiencias en los mecanismos de reparación del ácido desoxirribonucleico constituyen un factor de riesgo para el desarrollo del cáncer, como ocurre en el xeroderma pigmentoso. OBJETIVOS: evaluar el fenotipo de la reparación por escisión de nucleótidos en pacientes cubanos con una elevada hipersensibilidad al sol, y la sospecha clínica de xeroderma pigmentoso en la fase eritematopigmentaria, mediante la variante alcalina del ensayo cometa. MÉTODOS: se estudiaron 28 pacientes, con predominio de las edades pediátricas. Como inductor del daño al ácido desoxirribonucleico se utilizó la radiación ultravioleta C (254 nm) a una dosis de 40 J/m². El daño del ácido desoxirribonucleico se cuantificó inmediatamente, después de irradiar las células (tiempo 0 minutos) y un tiempo después de la irradiación, incubado a 37 ºC en medio de cultivo, enriquecido con suero fetal al 10 % (tiempo 45 min). Con estos datos se determinó el por ciento de la diferencia en las unidades arbitrarias (UA) entre ambos momentos. RESULTADOS: no se obtuvieron diferencias significativas (p= 0,080976) entre el grupo de pacientes (224,23 UA) y el grupo de sujetos controles (195,43 UA). Los pacientes reconocieron y escindieron el daño inducido en el ácido desoxirribonucleico por luz ultravioleta C, con una eficiencia similar a la de los controles. CONCLUSIONES: el ensayo cometa alcalino acoplado a radiación ultravioleta C permitió identificar, claramente y de forma indirecta, el funcionamiento de los mecanismos de reparación por escisión de nucleótidos, donde actúan las proteínas XPA a XPG. Los sujetos en estudio fueron excluidos de presentar la forma clásica de la enfermedad.

INTRODUCTION: deficiencies in the deoxyribonucleic acid repair mechanisms are a risk factor for cancer as is the case of xeroderma pigmentosum. OBJECTIVES: to evaluate the phenotype of nucleotide excision repair in Cuban sun hypersensitive patients with clinical suspicion of xeroderma pigmentosum at erythematopigmentary phase, by using the Comet assay alkaline variant. METHODS: twenty eight patients mainly at pediatric ages were studied. The used DNA damage inducer was ultraviolet radiation C (254 nm) at 40 J/m2 dose. The DNA damage was quantified immediately after cell irradiation (0 minutes) and some time afterwards, then cultured at 37 ºC and enriched with 10 % fetal serum (45 minutes). This data allowed determining the percentage of difference in arbitrary units (AU) between both moments. RESULTS: there was no significant differences (p= 0.080976) between the group of patients (224.23 AU) and the control group (195.43 UA). The UV-C induced DNA damage was recognized and excised in the patients with similar effectiveness to that of the controls. CONCLUSIONS: the UV-C radiation-coupled alkaline comet assay allowed clearly and indirectly identifying the functioning of the nucleotide excision repair mechanisms in which XPA to XPG proteins influence. The studied subjects did not show the classical form of this disease.

Susceptibilidad antimicrobiana y diseminación policlonal de cepas de Staphylococcus aureus / Antimicrobial susceptibility and polyclonal dissemination of Staphylococcus aureus strains

Objectives: To determine the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), its antimicrobial susceptibility patterns and classify strains by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).Material and Methods: 106 S. aureus strains isolated from patients hospitalized at the Maracaibo city university hospital, Venezuela, were processed during the first quarter of 2009. The culture, isolation and identification of S. aureus were done by conventional methods. Antimicrobial susceptibility was determined by the disk diffusion method. The presence of mecA gene in MRSA strains was verified using the polymerase chain reaction (PCR). Results: Fifty-four strains (50.94%) were MRSA and twenty three antibiotypes were detected. The most frequently observed was the one including β-lactams, macrolides, lincosamides, aminoglycosides and quinolones. There were forty multi-resistant isolates (74.0%) between MRSA strains. All methicillin-resistant isolates were mecA positive. PFGE classified MRSA stains in 50 pulsotypes, each one containing between six and thirteen bands. Four small groups, of two strains each, had 80% of similarity. Five of the eight strains in these small clusters (62.50%) had the same pattern of resistance. Conclusion: There is a high prevalence of multi-resistant MRSA strains with polyclonal dissemination in the hospital.

Objetivo: Determinar la prevalencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y tipificar las cepas mediante electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP). Materiales y Métodos: 106 cepas de S. aureus aisladas de pacientes recluidos en un hospital universitario de la ciudad de Maracaibo, Venezuela, fueron procesadas durante el primer trimestre del 2009. El cultivo, aislamiento e identificación de las cepas se hizo por los métodos convencionales. La susceptibilidad antimicrobiana fue determinada por el método de difusión con disco. Se verificó la presencia del gen mecA en las cepas de SARM mediante la reacción de polimerasa en cadena (RPC). Resultados: Cincuenta y cuatro cepas (50,9%) eran SARM y se detectaron veintitrés antibiotipos, siendo el que incluye β-lactámicos, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos y quinolonas, el más frecuentemente observado (55,5%). Hubo cuarenta aislados (74,0%) multi-resistentes entre las cepas de SARM. Todas las cepas resistentes a meticilina fueron positivas para mecA. Por EGCP, las cepas de SARM fueron clasificadas en 50 pulsotipos, según el perfil de cortes obtenidos, conteniendo cada uno, entre seis y trece bandas. Cuatro grupos, de dos cepas cada uno, fueron detectados con 80% de similitud. Cinco de las ocho cepas en estos grupos (62,5%) tenían el mismo patrón de resistencia. Conclusión: En el hospital, existe una alta prevalencia de cepas SARM multi-resistentes con difusión policlonal.

Diversidad genética de cepas de Escherichia coli O145: NM/H27 aisladas en la provincia de Buenos Aires / Genetic diversity of Escherichia coli 0145: NM/H27 strains isolated in Buenos Aires province / Diversidade genética de cepas de Escherichia coli 0145: NM/H27 isoladas na provincia de Buenos Aires

Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC), fundamentalmente del serotipo O157:H7, está asociada a la ocurrencia de casos esporádicos y brotes de diarrea sanguinolenta (DS) y síndrome urémico hemolítico (SUH). Otros serotipos STEC como O26:H11, O103:H2, O111:NM, O113:H21 y O145:NM también pueden causar enfermedad severa. En Argentina O157:H7 es el serotipo prevalente siguiéndole en frecuencia O145:NM. El objetivo del presente trabajo fue establecer la diversidad genética y la relación clonal de cepas de E. coli O145:NM/H27 aisladas en diferentes localidades de la provincia de Buenos Aires en el período 2004-2009. A 17 cepas aisladas de casos de SUH (9), DS (5) y de contactos asintomáticos (3) se les realizó PCR para detectar genes stx1, stx2, rfbO157, eae y ehxA y electroforesis en gel en campos pulsados (Xbal-PFGE) para establecer diversidad genética y relación clonal. Todos los aislamientos fueron caracterizados genotípicamente como stx2/eae/ehxA. Por %baI-PFGE se obtuvieron 14 patrones diferentes, identificándose un único Cluster. Mediante la sub-tipificación molecular se conformó la base de datos de E. coli O145:NM/ H27 aislados en la región que permitirá monitorear los perfiles %baI-PFGE a fin de identificar tempranamente la probable ocurrencia de un brote en la población y notificar a las autoridades para aplicar acciones de control.

SHIGA TOXIN-PRODUCING Escherichia coli (STEC), especially the serotype 0157-.H7, is associated with the occurrence of sporadic cases and outbreaks of bloody diarrhea (DS) and hemolytic uremic syndrome (HUS). Other STEC serotypes such as 026:H11, 0103:H2, 0111:NM, 0113:H21, and 0145:NM can also cause severe human illness. In Argentina 0157:H7 is prevalent, followed in frequency by serotype 0145:NM. The aim of this study was to determine the genetic diversity and clonal relationship of E. coM 0145:NM/ H27 strains isolated in different locations of the Buenos Aires province, in the period 2004-2009. A total of 17 strains isolated from HUS (9), DS (5) and asymptomatic contacts (3) were characterizea by POR to detect stXj, stx2, rfbO157, eae and ehxA genes, and pulsed-field gel electrophoresis (Xbal-PFGE) to establish the genetic diversity and the clonal relationship. All isolates were characterized as stx2/eae/ehxA. By Xba/-PFGE, 14 different patterns were established, with a single cluster identified. A regional database of E. coii 0145:NM/H27 was created, which will monitor the /-PFGE profiles of the circulating strains in order to identify the probable occurrence of an outbreak in the community and report to the authorities to implement control measures.

Escherichia coii produtora de toxina Shiga (STEO), especialmente do sorotipo 0157:H7, é associado com a ocorrència de casos esporádicos e surtos de diarreia sanguinolenta (DS) e a síndrome urèmica hemolítica (HUS). 0utros sorotipos STEO como 026H11, 0103H2, 0111NM, 0113H21, e 0145NM também podem causar doengas severas. Na Argentina, é o sorotipo prevalente seguindo em frequència 0145-.NM. 0 objetivo deste estudo foi determinar a diversidade genética e a relagäo clonal de cepas de E. coii 0145:NM/H27 isoladas em diferentes locais da provincia de Buenos Aires, no período 2004-2009. Foi realizado POR em um total de 17 cepas isoladas de casos de HUS (9), DS (5) e de contatos assintomáticos (3) para detectar genes stx1, stx2, rfbO157, eae e ehxA e eletroforese em gel em campos pulsados (Xba/ -PFGE) para estabelecer diversidade genética e a relagäo clonal. Todos os isolamentos foram caracterizados genotipicamente como stx2/eae/ehxA. Por Xba/-PFGE foram obtidos 14 padröes diferentes, identificando um só cluster. Através da subtipificagäo molecular foi conformada a base de dados de E. coii 0145:NM/H27 isolados na regiäo, que irá permitir monitorar os perfis Xba/-PFGE visando identificar precocemente a provável ocorrència de um surto na populagäo e notificar às autoridades para implementar medidas de controle.

Molecular serovar characterization of Leptospira isolates from animals and water in Colombia / Caracterización molecular de serovariedades de Leptospira spp. aisladas de muestras de animales y agua en Colombia

Introduction: Leptospirosis is a bacterial disease transmitted directly or indirectly from animals to humans that may result in severe hemorrhagic, hepatic/renal and pulmonary disease. There are 20 known Leptospira species and hundreds of serovars, some of which belong to different species. It is essential to identify pathogenic Leptospira serovars and their potential reservoirs to prepare adequate control strategies. Objective: To characterize the Leptospira serovars isolated from rodents, dogs, pigs and water samples in Colombia. Materials and methods: Leptospira organisms were isolated and cultured, and pathogenic strains were identified using a polymerase chain-reaction (PCR). Leptospira DNA and Salmonella Braenderup H9812 (molecular weight standard) DNA were cleaved using NotI and subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The PFGE patterns were analyzed based on bacterial strain-typing criteria and Dice coefficients (DCs) between these isolates and over 200 Leptospira organisms isolated from other parts of the world. Results: All of the isolates were pathogenic strains, and five were genetically characterized. The P275 (84% DC) and P282 (95% DC) pig isolates were related to the Leptospira interrogans Pomona serovar; the I15 (DC: 100%) rat isolate was identical to the Leptospira interrogans Icterohameorrhagiae or Copenhageni serovars, while the C67 (64% DC) dog and A42 (60% DC) water isolates were not related (< 73.7% DC) to any of the 200 reference serovars; the closest serovars were the Leptospira noguchii Nicaragua and Orleans serovars, respectively. Conclusion: This was the first molecular characterization of Colombian Leptospira spp isolates; these isolates will be used to develop a Colombian diagnostic panel.

Introducción. La leptospirosis es una infección bacteriana transmitida directa o indirectamente de animales a humanos, la cual puede resultar en una enfermedad hemorrágica grave, hepática o renal y pulmonar. Hay 20 especies de Leptospira conocidas y cientos de serovariedades, algunas de las cuales pertenecen a diferentes especies. Es esencial identificar las serovariedades patógenas y sus reservorios potenciales para enfocar estrategias de control. Objetivo. Caracterizar las serovariedades de Leptospira aisladas de muestras de roedores, perros, cerdos y agua en Colombia. Materiales y métodos. Las cepas de leptospiras aisladas fueron identificadas como patógenas usando la reacción en cadena de la polimerasa (PRC). Sus ADN y el ADN de Salmonella Braenderup H9812 (marcador de peso molecular) fueron cortados con NotI y corridos en electroforesis de campo pulsado. Los patrones de la ECP se analizaron con base en los criterios de tipificación para cepas bacterianas y el coeficiente de Dice, cuando se compararon con 200 cepas aisladas en otras partes del mundo. Los perfiles de ADN con un coeficiente de Dice entre 73,7 % y 100 % se consideraron pertenecientes a la misma especie. Resultados. Todos los aislamientos fueron cepas patógenas y cinco se caracterizaron genéticamente. El aislamiento P275 (coeficiente de Dice: 84 %) y el P282 (coeficiente de Dice: 95 %) de cerdos, se relacionaron con Leptospira interrogans de serovariedad Pomona; el aislamiento de rata (I15) fue indistinguible de Leptospira interrogans de serovariedades Icterohaemorrhagiae o Copenhageni (coeficiente de Dice: 100 %), mientras que los aislamientos de perro (C67) y agua (A42) no se relacionaron (coeficiente de Dice <73,7 %) con ninguna de las 200 cepas de referencia; las más cercanas fueron Leptospira noguchii de serovariedades Nicaragua (coeficiente de Dice: 63 %) y Orleans (coeficiente de Dice: 60 %). Conclusiones. Esta fue la primera caracterización molecular de serotipos de aislamientos colombianos, los cuales serían los primeros miembros de un panel diagnóstico colombiano.

Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae serotype 1 invasive isolates in Colombia / Caracterización molecular de cepas invasoras de Streptococcus pneumoniae serotipo 1 aisladas en Colombia

OBJECTIVE: To determine the genetic relationship between Streptococcus pneumoniae serotype 1 Colombian isolates recovered from invasive disease between 1994 and 2011 and recognized serotype 1 international clones. METHODS: A total of 135 S. pneumoniae serotype 1 isolates with epidemiological and antimicrobial susceptibility data (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012) were studied. The genetic relationship with recognized international clones was established by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with SmaI restriction enzyme. Multilocus sequence typing (MLST) was standardized to determine the sequence type (ST) in seven isolates representing different clonal groups. Control and reference strain R6, and clones Sweden¹ ST217, Sweden¹ ST304, Sweden¹ ST306, and USA¹ ST615, were used. RESULTS: PFGE revealed that 89.7% of the isolates were associated with Sweden¹ ST306, 3.7% were associated with Sweden¹ ST304, and 6.6% were not clonally related. Using MLST, ST306 was confirmed in six isolates and ST304 in one. CONCLUSIONS: In contrast to Brazil and the United States, where clones Sweden¹ ST304 and ST227 prevail, invasive disease caused by S. pneumoniae serotype 1 in Colombia is principally associated with the dispersion of isolates related to clone Sweden¹ ST306.

OBJETIVO: Determinar la relación genética entre las cepas de Streptococcus pneumoniae serotipo 1 aisladas en Colombia en casos de enfermedad invasora entre 1994 y 2011 y los clones internacionales reconocidos del serotipo 1. MÉTODOS: Se estudiaron un total de 135 cepas de S. pneumoniae serotipo 1 de las que se tenían datos epidemiológicos y de sensibilidad a los antimicrobianos (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012). Se estableció su relación genética con los clones internacionales reconocidos mediante electroforesis en gel de campo pulsátil (PFGE) utilizando la enzima de restricción SmaI. Se estandarizó la tipificación de secuencias mulitlocus (MLST) para determinar el tipo de secuencia (ST) en siete cepas que representaban diferentes grupos clonales. Se utilizaron la cepa de control y referencia R6 y los clones Sweden¹ ST217, Sweden¹ ST304, Sweden¹ ST306, y USA¹ ST615. RESULTADOS: La PFGE reveló que 89,7% de las cepas se asociaban con Sweden¹ ST306, 3,7% con Sweden¹ ST304, y 6,6% no mostraron relación clonal. Mediante MLST, se confirmó la relación con ST306 en seis cepas y con ST304 en una. CONCLUSIONES: A diferencia de Brasil y Estados Unidos, donde prevalecen los clones Sweden¹ ST304 y ST227, la enfermedad invasora causada por S. pneumoniae serotipo 1 en Colombia se asocia principalmente con la dispersión de cepas relacionadas con el clon Sweden¹ ST306.

Diversidad genética de aislamientos peruanos de Leptospira spp. mediante electroforesis en gel de campo pulsado / Genetic diversity of Peruvian isolates of Leptospira spp. through pulsed field gel electrophoresis

Objetivos. Determinar la diversidad genética de aislamientos peruanos de Leptospira spp. mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Materiales y métodos. Se estandarizó la metodología de PFGE propuesta por Galloway y Levett (2008). Se elaboró una base de datos con los perfiles de PFGE de 65 cepas de referencia y se aplicó la técnica en 111 aislamientos de Leptospira spp. obtenidos en Perú entre 2002 y 2010. Resultados. Se determinó gran diversidad genética de serovares de Leptospira spp. circulantes en nuestro país. Se identificaron 57 serovares, 47 en 97 aislamientos patógenos. Los serovares más frecuentes fueron Icterohaemorrhagiae/Copenhageni (n=24) y Canicola (n=7). Las especies más frecuentes fueron L. santarosai (49,5%) y L. interrogans (37,1%). La distribución de especies, clusters y serovares varió según la fuente del aislamiento, el contexto ambiental y la procedencia. Conclusiones. Existe gran diversidad de serovares circulantes en el Perú, la cual está relacionada a la especie, el reservorio, el contexto ambiental y la procedencia del aislamiento. Se evidencia las relaciones genéticas y epidemiológicas entre aislamientos de diferentes fuentes, lo cual está relacionada a la especie, el reservorio, el contexto ambiental y la procedencia del aislamiento.

Objectives. Determine the genetic diversity of Peruvian isolations of Leptospira spp. through Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Materials and methods. The PFGE methodology proposed by Galloway and Levett (2008) was standardized. A database including the PFGE profiles of 65 reference strains was prepared, and the technique was applied in 111 isolates of Leptospira spp. obtained in Peru between 2002 and 2010. Results. A great generic diversity of serovars of circulating Leptospira spp. was determined in our country. 57 serovars were identified, 47 out of 97 pathogen isolates. Most frequent serovars were Icterohaemorrhagiae/Copenhageni (n=24) and Canicola (n=7). The most frequent species were L. santarosai (49,5%) and L. interrogans (37,1%). The distribution of species, clusters and serovars changed according to the source of isolate, the environmental context and the origin. Conclusions. There is great diversity of circulating serovars in Peru. There are genetic and epidemiological relations among isolates of different sources, and this is related to species, reservoir, environmental context and the origin of the isolate.

Neutralización heteróloga e interacción de amanitinas con venenos de Bothropsy Crotalus y de abeja / Heterologous neutralization and interaction of toxic amanitins with Bothrops and Crotalus venoms, and honey bee venom / Neutralização heteróloga e interação das amanitinas tóxicas com veneno de Bothrops e Crotalus e veneno de abelha

En el presente trabajo se examinó la interacción de las amanitinas de Amanita phalloides (Basidiomycetes) con los venenos de las serpientes Bothrops neuwiedi diporus ("yarará pequeña"), B. alternatus ("yarará grande"), Crotalus durissus terrificus ("serpiente de cascabel") y de la abeja mielera Apis mellifera. Se aplicaron las técnicas de Ouchterlony, inmunotransferencia, electroforesis rocket y electroforesis en gel de poliacrilamida a los anti-venenos y anti-toxinas obtenidos por inmunización en caballos y/o en conejos. Los anti­sueros de serpientes y las amanitinas reaccionaron en forma cruzada, así como el veneno de abeja y las amanitinas. Cuando los venenos de Bothrops neuwiedii diporus y Crotalus durissus terrificus se preincubaron con las amanitinas y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE), algunas bandas de proteínas desaparecieron y otras se redujeron notablemente. Estos resultados revelan por primera vez la interacción y la degradación de las proteínas de los venenos de serpientes por las amanitinas. Por otra parte, la modificación del tiempo de coagulación de la sangre humana, debida a los venenos, se corrigió con los ciclopéptidos de Amanita. Estos resultados también se informan por primera vez en este trabajo. La presencia de polipéptidos tóxicos en los venenos de serpientes y abejas, así como en A. phalloides y la reactividad cruzada demostradas en este trabajo, sugieren la existencia de epítopos comunes a todos ellos. Teniendo en cuenta estas reacciones, el uso de anti-venenos heterólogos parece ser de utilidad en el tratamiento del envenenamiento.

In the present work, the interaction of the amanitins of Amanita phalloides (Basidiomycetes) with the venoms of Bothrops neuwiedi diporus ("small yarará snake"), B. alternatus ("big yarará"), Crotalus durissus terrificus ("rattlesnake"), and honey bee Apis mellifera was examined. Ouchterlony, immunotransfer, rocket-electrophoresis, and polyacrylamide gel electrophoresis techniques were applied to anti-venoms and anti-toxins obtained by immunization in horses and/or in rabbits. Snake antisera and amanitins cross-reacted as well as bee venom and amanitins. When venoms of Bothrops neuwiedii diporus and Crotalus durissus terrificus were preincubated with amanitins and analysed by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), some protein bands disappeared and others were significantly reduced. These results reveal for the first time the interaction and degradation of proteins in snake venoms by amanitins. Moreover, the modification of the human blood clotting time due to snake venoms was corrected by the Amanita cyclopeptides. These results are also reported for the first time in this work. The occurrence of toxic polypeptides in the snake and bee venoms as well as in A. phalloides, and the cross-reactivity demostrated herein, suggest the occurrence of epitopes common to all of them. Taking into account these reactions,the use of heterologous anti-venoms seems to be of value in envenomation treatment.

No presente trabalho foi examinada a interação das amanitinas de Amanita phalloides (Basidiomy­cetes) com os venenos das serpentes Bothrops neuwiedi diporus ("jararaca-cruzeira"), B. alternatus ("urutu"), Crotalus durissus terrificus ("serpente cascavel") e da abelha-europeia Apis mellifera. Foram aplicadas as técnicas de Ouchterlony, imunotransferência, eletroforese rocket e eletroforese em gel de poliacrilamida aos anti-venenos e anti-toxinas obtidos por imunização em cavalos e/ou em coelhos. Os anti-soros de serpentes e as amanitinas reagiram em forma cruzada, bem como o veneno de abelha e as amanitinas. Quando os venenos de Bothrops neuwiedii diporus e Crotalus durissus terrificus foram incubados previamente com as amanitinas e foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE), algumas faixas de proteínas desapareceram e outras se reduziram notavelmente. Estes resultados revelam por primeira vez a interação e a degradação das proteínas dos venenos de serpentes pelas amanitinas. Por outra parte, a modificação do tempo de coagulação do sangue humano, devido aos venenos, se corrigiu com os ciclopeptídeos de Amanita. Estes resultados também se informam por primeira vez neste trabalho. A presença de polipeptídeos tóxicos nos venenos de serpentes e abelhas, bem como em A. phalloides e a reatividade cruzada demonstradas neste trabalho, sugerem a existência de epítopos comuns a todos eles. Levando em consideração estas reações, o uso de anti-venenos heterólogos parece ser de utilidade no tratamento do envenenamento.

Técnicas electroforéticas en el HYDRASYS 2. Utilidad diagnóstica en diferentes enfermedades / Electrophoretic techniques in HYDRASYS 2. Diagnostic usability in different diseases

Se presentan los resultados de la estandarización de las técnicas de electroforesis de hemoglobina (Hb), isoenzimas de la deshidrogenasa láctica (LDH) y proteinuria en el equipo Hydrasys 2, así como el estudio de pacientes atendidos en el Instituto de Hematología e Inmunología y en otros centros hospitalarios del país. Se realizó el diagnóstico de 149 portadores de hemoglobinopatías (AS, AC, b talasemia heterocigótica, variante rápida), 60 enfermos (SS, SC, CC), 24 pacientes con a talasemia o deficiencia de hierro y se cuantificó la hemoglobina fetal a 93 casos con hemoglobinopatía S. Se determinaron los valores normales de actividad e isoenzimas de LDH en la población mediante el estudio de 50 donantes de sangre. En los pacientes con anemia drepanocítica se encontró un aumento significativo de la isoenzima 1 (p= 0,000) y disminución de isoenzimas 3 (p= 0,002). Se realizó el estudio de proteínas en orina a 8 pacientes con enfermedades hematológicas que presentaron microalbuminuria al menos en 2 ocasiones, con concentraciones ³ 0,04 g/L. En 2 pacientes el resultado fue normal; en 2 se encontraron proteínas de origen tubular; y en otros 2, proteínas de origen glomerular

We present the results of the standardization of the techniques of electrophoresis of hemoglobin (Hb), lactate dehydrogenase isoenzymes (LDH) and proteinuria in HYDRASYS 2 equipment, and the study of patients treated at the Institute of Hematology and Immunology and other hospitals in the country. 149 hemoglobinopathies carriers were diagnosed (AS, AC, b thalassemia heterozygous fast variant), 60 patients (SS, SC, CC), 24 patients with athalassemia or iron deficiency. Fetal hemoglobin was quantified in 93 cases with hemoglobinopaty S. Normal values of activity and LDH isoenzymes were determined in the population through the study of 50 blood donors. In patients with sickle cell anemia we found a significant increase in isoenzyme 1 (p=0.000) and isozyme 3 decreased (p=0.002). We performed the study of proteins in urine in 8 patients with hematologic malignancies who had microalbuminuria at least 2 times, with concentrations ³ 0.04 g / L. In 2 patients the results were normal, in 2 proteins were tubular origin, and in 2, proteins of glomerular origin