Análise Técnico-Econômica para a produção de biofármacos de L-asparaginase / Technical-Economic analysis for the production of L-asparaginase biopharmaceuticals

A enzima L-asparaginase é comumente utilizada como biofármaco para o tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda e possui altas taxas de cura com o medicamento disponível no mercado. Atualmente a aquisição deste biofármaco é fruto integral de importação, não sendo realizada produção nacional, muito embora existam grupos de pesquisas nacionais que trabalham em pesquisas e no desenvolvimento de biofármacos alternativos da L-asparaginase. Assim, a presente dissertação tem como objetivo realizar análises técnico-econômicas para avaliar a viabilidade de implementação industrial de bioprocessos para a produção da L-asparaginase do tipo Erwinase PEGuilada e não PEGuilada, que foram previamente desenvolvidos na FCF-USP. As análises técnico-econômicas foram conduzidas por meio do software SuperPro Design® (Intelligen, Inc.) e permitiram adaptar o processo laboratorial para um processo piloto e possibilitaram estimar os valores de custo de produção unitário (Unity Cost of Production - UPC) de US$ 12,37/mg e US$ 3,46/mg para a L-asparaginase monoPEGuilada e nativa obtida por processo similar, respectivamente. O custo unitário de produção para a enzima peguilada foi, portanto, estimado em cerca de 4 vezes o mesmo custo para a produção da enzima peguilada, sendo tal aumento de custo devido às operações de peguilação, já que ambas as plantas foram mantidas nas mesmas dimensões. Ainda, foram obtidos indicadores econômicos, que indicam a atratividade do processo desenvolvido, muito embora tenham sido identificados diversos gargalos de processo e fatores a serem otimizados e melhorados de forma a tornar o processo mais atrativo sob os pontos de vista técnico e econômico. Em uma análise de sensibilidade preliminar um aumento factível da densidade celular já mostra que é possível reduzir em mais de 30% o UPC. De toda forma, ainda que não otimizado, o processo apresentou valores e dados compatíveis com os biofármacos de L-asparaginase já disponíveis no mercado

The enzyme L-asparaginase is commonly used as a biopharmaceutical in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, presenting high cure rates with the formulations available on the market. Nowadays, the acquisition of this biopharmaceutical is only from importation, given that there is no national production being carried out, although there are national research groups working on research and development of alternative L-asparaginase biopharmaceuticals. Thus, this project aims at carrying out technical-economic analyzes to evaluate the viability of industrial implementation of bioprocesses for the production of L-asparaginase of the PEGylated and non-PEGylated Erwinase type previously developed at FCF-USP. The technical-economic analyzes, conducted by means of the software SuperPro Design® (Intelligen, Inc.), allowed to adapt the laboratory process to a pilot process and made it possible to estimate the unit cost of production (UPC) values of US $ 12.37 / mg and US $ 3.56 / mg for monoPEGylated L-asparaginase and bare obtained by similar process, respectively. The unit cost of production for the pegylated enzyme was, therefore, estimated at about 4 times the same cost for the production of the pegylated enzyme, such an increase in cost due to pegylation operations, since both plants were maintained in the same dimensions. Moreover, economic indicators were obtained, which indicate the attractiveness of the developed process. However, several process bottlenecks and factors to be optimized and improved were identified to make the process more attractive from the technical and economic point of view. In a preliminary sensitivity analysis, a feasible increase in cell density already shows that it is possible to reduce UPC by more than 30%. Accordingly, although not optimized, the process presented values and data compatible with the L-asparaginase biopharmaceuticals already available on the market

L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos / L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi: cell-free protein expression and bioconjugation to bacteriophages

A L-Asparaginase (L-ASNase) de Erwinia chrysathemi (ErA) é uma enzima amplamente utilizada para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). Embora o seu uso como segunda linha de tratamento para a LLA tenha proporcionado consideráveis benefícios clínicos, reações de hipersensibilidade e rápida depuração plasmática ainda são problemas recorrentes. Ademais, extensivos e custosos processos de produção da ErA são necessários para a obtenção da enzima pura. Com base nesses problemas, o presente trabalho propõe (1) o estudo de viabilidade de expressão da ErA em um sistema de síntese proteica livre de células (SPLC) e (2) a conjugação da proteína em bacteriófagos como ferramenta alternativa para o isolamento e monitoramento da depuração plasmática da ErA. Foram utilizados extratos celulares de Escherichia coli suplementados com solução energética contendo creatina fosfato (CP) como fonte de energia para síntese in vitro de ErA. Para conjugação da ErA a bacteriófagos, o sistema SpyTag/SpyCatcher foi implementado: SpyCatcher foi fusionado à porção N-terminal da ErA e bacteriófagos filamentosos da linhagem M13 e fd foram modificados de modo a expressar SpyTag nas proteínas de capsídeo pIII e pVIII, respectivamente. Em relação ao primeiro objetivo, o sistema de SPLC foi capaz de expressar a ErA com atividade. A proteína foi expressa na fração solúvel e apresentou atividade enzimática significativamente superior em relação à reação controle (7,07 ± 0,68 U/mL vs. 1,83 ± 0,14 U/mL). Tempo necessário para obtenção do extrato celular foi reduzido de 45 para 26 hrs, e sete componentes da solução energética foram removidos da composição original sem implicações negativas na eficiência de expressão da ErA, simplificando desta forma o processo de SPLC. Em relação ao segundo objetivo, ErA fusionada à SpyCatcher (SpyCatcher_ErA) foi conjugada com êxito em bacteriófagos capazes de expressar SpyTag fusionadas na porção N-terminal das proteínas pIII (SpyTag_pIII) e pVIII (SpyTag_pVIII). A porcentagem de formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pIII ((ErA)5-pIII) foi de 6% enquanto formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pVIII ((ErA)50-pVIII) foi de 46%, valores estes confirmados por atividade enzimática. Solução contendo conjugados foram injetados em camundongos e sequenciados/titulados com êxito. Não houve diferença de depuração plasmática entre (ErA)5-pIII e bacteriófago controle, mas houve maior taxa de eliminação de (ErA)50-pVIII em relação ao mesmo bacteriófago não conjugado à SpyCatcher_ErA. Os resultados aqui apresentados confirmam ser possível expressar ErA com atividade biológica em sistemas de SPLC. Além disso, o sistema de conjugação da ErA a bacteriófagos aqui desenvolvido foi capaz de monitorar a concentração de ErA presente na circulação em função do tempo, tornando-se uma potencial plataforma de desenvolvimento de novas proteoformas da ErA com características clínicas melhoradas

L-Asparaginase (L-ASNase) from Erwinia chrysanthemi (ErA) is a widely used enzyme for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Although its use as a second-line treatment has provided significant clinical benefits, hypersensitivity reactions and a fast clearance rate are recurring L-ASNase-related problems. In addition, extensive and costly production processes are required for the manufacturing of pure ErA. Based on these drawbacks, this current work proposes (1) the study of the use of a cell-free protein synthesis (CFPS) system as a viable platform for the synthesis of ErA and (2) the conjugation of the protein on bacteriophages as an alternative tool for the isolation and monitoring of ErA clearance. Escherichia coli-derived cell extracts supplemented with a creatine phosphate-based energy solution were used to synthesize ErA in vitro. To conjugate ErA on bacteriophages, the SpyTag/SpyCatcher system was implemented: SpyCatcher was fused to the N-terminus of the ErA while filamentous phage strains M13 and fd were engineered in order to display SpyTag on their pIII and pVIII capsid proteins, respectively. Regarding the first goal, the CFPS system was able to express an active ErA. The protein was expressed in the soluble fraction and there presented a significant higher enzymatic activity compared to the control reaction (7.07 ± 0.68 U/mL vs. 1.83 ± 0.14 U/mL). Time required to obtain the cell extract was reduced from 45 to 26 hours, and seven energy solution reagents were removed from the original solution without compromising the efficiency of ErA expression, thus simplifying the CFPS process. With respect to the second goal, ErA fused to SpyCatcher (SpyCatcher_ErA) was sucessfully conjugated on bacteriophages capable of displaying SpyTag fused to the Nterminus of the pIII (SpyTag_pIII) or pVIII (SpyTag_pVIII) proteins. Percentage of conjugate formation between SpyCatcher_ErA and SpyTag_pIII (ErA)5-pIII was 6% whereas conjugate formation between SpyCatcher_ErA and SpyTag_pVIII (ErA)50-pVIII was 46%, values that were confirmed by enzymatic activity. Sample containing conjugates were injected into mice and sucessfully sequenced/titrated. No clearance differences were observed between (ErA)5- pIII and a control bacteriophage, but a higher clearance rate was observed for (ErA)50-pVIII compared to SpyTag_VIII non conjugated to SpyCatcher_ErA. The results here presented confirm the expression of a biologically active ErA from a CFPS system. Besides, the development of a conjugation system capable of linking ErA to bacteriophages could be used as a means to monitor the ErA concentration in the blood as a function of time and also as a potential platform to be used in the development of novel ErA proteoforms with improved clinical properties