Hematological and hemostaseological alterations after warm and cold limb ischemia-reperfusion in a canine model / Alterações hematológicas e hemostaseológicas após isquemia-reperfusão morna e fria de membro inferior em modelo canino

PURPOSE: Acute ischemia-reperfusion (I/R) of extremities means serious challenge in the clinical practice. Furthermore, the issue of preventive cooling is still controversial. In this canine model we investigated whether limb I/R -with or without cooling- has an influence on hematological and hemostaseological factors. METHODS: Femoral vessels were exposed and clamped for 3 hours. After release the clamps, 4-hour reperfusion was secured. The same procedures with cooling using ice bags, as well as warm and cold sham-operations were performed. Before operations, from the excluded limb by the end of ischemia, during the reperfusion, and for 5 postoperative days afterwards blood samples were collected for testing hematological and blood coagulation parameters. RESULTS: After I/R activated partial thromboplastin time was elongated on 2nd-4th postoperative days. The highest values were on the 2nd day in cold I/R group, accompanied by increased prothrombin time values. The hematological parameters and fibrinogen level showed non-specific changes. In excluded ischemic limb the blood composition showed controversial data. Cold ischemia induced larger alterations, however platelet count, hematocrit changed more expressly in warm ischemia. CONCLUSION: These results indicate the risk of coagulopathy following limb I/R on early post-eventually days, which risk is higher in the case of cold I/R.

OBJETIVO: Isquemia-Reperfusão aguda (I/R) de extremidades representa um desafio sério na prática clínica. Além disso, o tema de prevenção pelo resfriamento é ainda controverso. Nesse modelo canino, investigou-se se I/R de membros -com ou sem resfriamento- tem influência nos fatores hematológicos e hemostaseológicos. MÉTODOS: Os vasos femorais foram expostos e clampeados por 3 horas. Após liberação dos clampes, foi realizada a reperfusão por 4-horas. Os mesmos procedimentos com e sem resfriamento usando bolsas de gelo, assim como operações simuladas com e sem resfriamento foram realizados. Antes das operações, do membro excluído ao final da isquemia, durante a reperfusão e por 5 dias de pós-operatório, amostras sanguíneas foram colhidas para exames hematológicos e parâmetros de coagulação. RESULTADOS: Após I/R, o tempo de tromboplastina parcial ativada foi alargado no 2º.-4º. dias de pós-operatório. Os valores mais altos foram no 2º.dia no grupo deI/R fria, acompanhada pelo aumento dos valores do tempo de protrombina. Os parâmetros hematológicos e o nível de fibrinogênio mostraram mudanças não específicas. No membro isquêmico excluído a composição sanguínea mostrou dados controversos. A isquemia fria induziu maiores alterações, entretanto, a contagem de plaquetas e o hematócrito mudaram mais expressivamente na isquemia morna. CONCLUSÃO: Estes resultados indicam risco de coagulopatia após I/R de membros nos dias mais precoces após o evento, sendo mais elevado no caso da I/R fria.

Imersão do pâncreas por 24 horas em solução de colagenase a 4ºC no isolamento de ilhotas de Langerhans / Immersion of pancreas for 24 hours in collagenase solution at 4ºC in Langerhans islets isolation

Objetivos: testar se a imersão do pâncreas em solução de 1 ou 2 mg/ml de colagenase em 4ºC por 24 horas, no isolamento experimental de ilhotas de Langerhans, aumenta o rendimento de ilhotas por grama de tecido pancreático. Métodos: estudo experimental com camundongos, realizado no Laboratório de Nefrologia do Instituto de Pesquisas Biológicas do Hospital São Lucas da PUCRS, Porto Alegre, RS. Após sacrifício dos animais sob anestesia, os pâncreas foram retirados e triturados, sendo divididos em quatro grupos, conforme a técnica utilizada para isolar as ilhotas. A) colagenase 1mg/mL, a 4ºC por 24 horas e posterior aquecimento a 39ºC por 15 minutos. B) colagenase 2mg/mL com as mesmas etapas anteriores. C) colagenase 1mg/mL com aquecimento da solução no mesmo dia da retirada, a 39ºC por 15 minutos. D) colagenase 2mg/mL com aquecimento da solução no mesmo dia da retirada, a 39ºC por 15 minutos. Verificamos a viabilidade das ilhotas através do teste do azul tripano. Resultados: as medianas da quantidade de ilhotas isoladas nos grupos A, B, C e D foram 9.142, 8.285, 2.813 e 3.199 respectivamente. O teste de Kruskal- Wallis demonstrou diferença significativa, com valor de H = 17,44 com a = 0,01 e, na comparação dos grupos entre si, demonstrou que não há diferença entre as soluções de colagenase com concentrações de 1 e 2 mg/dL. Os grupos com a imersão do tecido pancreático em solução de colagenase por 24 horas obtiveram três vezes mais ilhotas, quando comparados aos submetidos à digestão imediata, conforme teste de Dunn com a<0,05. O teste do azul tripano demonstrou uma vitalidade maior que 95% em todos os grupos. Conclusões: sugere-se que a imersão em colagenase por tempo mais prolongado melhora o processo de digestão do tecido pancreático, aumentando o rendimento de ilhotas isoladas por grama de tecido pancreático. A diferença de concentração entre as soluções de colagenase não afetou o resultado.

Aims: To test whether the immersion of the pancreas in solutions of 1 or 2 mg/mL of collagenase in 4°C for 24 hours, for the isolation of Langerhans islets, rises the yield of islets/ grams of pancreatic tissue. Methods: Experimental study with mouses, performed in the Laboratory of Nephrology of the Instituto de Pesquisas Biológicas do Hospital São Lucas da PUCRS, Porto Alegre, RS. After the animals have been sacrified under anesthesia, the pancreas were removed and divided in four groups, according the technique used for isolating the islets. A) collagenase 1mg/mL, in 4ºC for 24 hours and heating for 39ºC for 15 minutes. B) collagenase 2mg/mL with the same previous described steps. C) collagenase 1mg/ mL and heating of the solution in the same day, in 39ºC for 15 minutes. D) collagenase 2mg/mL and heating of the solution in the same day, in 39ºC for 15 minutes. We verified the viability of the islet through the trypan blue test. Results: The median numbers of isolated islets in the groups A, B, C and D were 9142, 8285, 2813 e 3199, respectively. Kruskal-Wallis test showed significant difference, with the value of H = 17,44 with a = 0,01, and in the comparison between the groups, there was o difference in the solutions of collagenase with concentrations of 1 and 2 mg/dL. Groups with immersion of pancreatic tissue in collagenase solution for 24 hours had three times more islets when compared to groups submitted to immediate digestion, according to Dunn test with a <0,05. The trypan blue test showed viability higher than 95% in all groups. Conclusions: We suggest that the immersion in solution of collagenase for longer time improves the process of digestion of pancreatic tissue, rising the yield of islets/ grams of pancreatic tissue. Different concentration between the collagenase solutions did not affect the final result.