Résumé
Abstract The present study outlines the conditioning of various parameters for the efficient removal of the apoplastic fraction of carnation enriched in polar compounds, mainly phenolics. Several studies can apply the described workflow to different plant species in the particular or global analysis of those metabolites in this peripheral extracellular space. Hence, using carnation (Dianthus caryophyllus L) roots and stems, we evaluated different infiltration solutions for removing apoplastic metabolites. The best outcome was obtained by using the buffer solution NaH2PO4-Na2HPO4 0.1 M pH 6.5/NaCl 50 mM, since the highest amount of apoplastic phenolic metabolites can be obtained with the slightest contamination of intracellular compounds. The metabolites were separated using HPLC-DAD-ESI-MS, affording chromatographic profiles with reasonable quality parameters based on resolution, selectivity, and number of theoretical plates. It was possible to identify eight differential compounds (one flavone and seven flavonols), whose core moieties consisted of (iso)pratol, kaempferide, (dihydro)kaempferol, quercetin, and myricetin-type flavonoids according to the test organ and the cultivar. We deduced that identified flavonoids are related to phytoanticipin-type metabolites in carnation, such as hydroxy-methoxyflavone, di-o-benzoylquercetin, and kaempferide disalicyloylrhamnoside, which are abundantly present in the resistant cultivar. The conditions described in this work are fundamental for delving into the role of apoplastic phenolic metabolites related to the defense mechanisms of this ornamental plant.
Resumen En el presente estudio se describe el acondicionamiento de algunos parámetros con fines de obtención eficiente de extractos apoplásticos enriquecidos en compuestos polares, principalmente fenólicos. Este flujo de trabajo descrito, incluso, puede ser aplicado a diferentes especies vegetales para ser empleado en el análisis particular o global de metabolitos en este espacio extracelular periférico. Para ello, usando raíces y tallos de clavel (Dianthus cariophyllus L), se evaluaron diferentes soluciones de infiltración para la extracción de los metabolitos apoplásticos. El mejor resultado se logró con la disolución amortiguadora NaH2PO4-Na2HPO4 0,1 M pH 6,5/NaCl 50 mM, porque se obtiene la mayor cantidad de metabolitos fenólicos apoplásticos, con la menor contaminación de compuestos intracelulares. Los metabolitos se separaron mediante HPLC-DAD-ESI-MS, obteniendo perfiles cromatográficos con parámetros de calidad razonables basados en resolución, selectividad y número de platos teóricos. Con estas condiciones, fue posible identificar ocho compuestos diferenciales (una flavona y siete flavonoles), cuyas estructuras básicas comprendían flavonoides del tipo (iso)pratol, kaempférido, (dihidro) kaempferol, quercetina y miricetina, según el órgano de prueba y la variedad. Los flavonoides identificados están relacionados con metabolitos de tipo fitoanticipina en el clavel, como hidroxi-metoxiflavona, di-o-benzoilquercetina y kaempférido disaliciloilrhamnósido, abundantemente presentes en la variedad resistente. Las condiciones descritas en este trabajo son fundamentales para profundizar en el papel de los metabolitos fenólicos apoplásticos relacionados con los mecanismos de defensa de esta planta ornamental.
Resumo O presente estudo descreve o condicionamento de alguns parâmetros para a obtenção eficiente de extratos apoplásticos enriquecidos em compostos polares, principalmente fenólicos. Este fluxo de trabalho descrito pode até mesmo ser aplicado a diferentes espécies de plantas para serem usadas na análise particular ou global de metabólitos neste espaço extracelular periférico. Para isso, utilizando raízes e caules de craveiro (Dianthus cariophyllus L), diferentes soluções de infiltração foram avaliadas para a extração de metabólitos apoplásticos. O melhor resultado foi obtido com a solução tampão NaH2PO4-Na2HPO40 0.1 M pH 6.5/NaCl 50 mM, pois a maior quantidade de metabólitos fenólicos apoplásticos é extraída. Os metabólitos foram separados por HPLC-DAD-ESI-MS, obtendo-se perfis cromatográficos com parâmetros de qualidade razoáveis baseados na resolução, seletividade e número de pratos teóricos. Nessas condições, foi possível identificar oito compostos diferenciais (uma flavona e sete flavonóis), cujas estruturas básicas compreendem flavonóides do tipo (iso) pratol, kaempferida, (dihidro)kaempferol, quercetina e miricetina, de acordo com o órgão e a variedade de craveiro utilizado. Os flavonóides identificados estão relacionados a metabólitos do tipo fitoanticipinas no craveiro, como hidroxi-metoxiflavona, di-O-benzoilquercetina e kaempférido disaliciloilramnósido, abundantemente ocorridos na cultivar resistente. As condições descritas neste trabalho são essenciais para se aprofundar no papel dos metabólitos fenólicos apoplásticos relacionados aos mecanismos de defesa dessa planta ornamental.
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Resumen En el presente trabajo se seleccionaron y validaron genes de referencia para estudios transcripcionales en el modelo clavel -Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Para ello, se seleccionaron genes asociados a procesos básicos celulares que han sido usados como genes de referencia en otros modelos planta-patógeno y se determinó el efecto de la inoculación del patógeno sobre su expresión. Se realizó un diseño de cebadores para los diferentes genes candidatos con el fin de verificar tanto su presencia en el genoma de claveles cultivados en Colombia, como su transcripción constitutiva en los diferentes tejidos por medio de la técnica de transcripción reversa y posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por sus siglas en ingles). Posteriormente, se evaluaron los niveles transcripcionales de los genes candidatos usando RT-qPCR en tallos y raíces de dos variedades con diferentes niveles de resistencia a la enfermedad, que fueron inoculados con este patógeno. La validación estadística realizada, usando ANOVA y los programas GeNorm y Normfinder, determinó que los genes codificantes para una histona H3 y el ARNr18S no presentan variación en sus niveles de expresión por efecto de la inoculación, permitiendo su uso como genes de referencia en estudios transcripcionales en esta interacción planta-patógeno.
Abstract In this research, reference genes were validated for transcriptional studies in the pathosystem carnation - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associated with basic cellular processes that have been used as reference genes in other plant-pathogen models were selected and the effect of the inoculation with the pathogen on their expression was determined. For this, it was necessary to design primers for each candidate genes to check their presence in the genome of carnations grown in Colombia and their constitutive transcription in different tissues of the plant using reverse transcription subsequent polymerase chain reaction (RT-PCR). The transcriptional levels of the candidate genes were evaluated using RT-qPCR in stems and roots inoculated with this pathogen for two cultivars with different levels of resistance to the disease. According to the statistical validation carried out using ANOVA and the GeNorm and Normfinder programs, the genes coding for a histone H3 and rRNA18S did not show any significant variation in their expression levels due to inoculation, so they can be used as reference genes in transcriptional studies in this plant-pathogen interaction.
Resumo Neste trabalho foram validados genes de referencia para estudos de transcrição no modelo cravo - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associados a processos básicos celulares, anteriormente usados como genes de referencia noutros modelos planta-patógeno, foram selecionados e se determinou o efeito, sobre a sua expressão, que apresentava a inoculação com o patógeno. Foi realizado um desenho de iniciadores para os diferentes genes candidatos para verificou a sua presença no genoma de cravos cultivados na Colômbia, e uma transcrição constitutiva em diferentes tecidos da planta com a técnica de transcrição reversa e posterior reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Em seguida, os níveis de transcrição dos genes candidatos foram avaliados por RT-qPCR em caules e raízes de duas variedades com diferentes níveis de resistência à doença, que tinham sido inoculados com o patógeno. A validação estatística realizada por ANOVA y com os programas GeNorm y Normfinder, permitiram determinar que os genes que codificam para uma histona H3 y para o ARNr 18S, não apresentam variação nos seus níveis de expressão por efeito da inoculação, sugerindo que podem ser usados como genes de referencia em estudos de transcrição nesta interação planta-patógeno.
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Resumen En el presente estudio se describe un flujo de trabajo que puede ser aplicado a diferentes especies vegetales, con el fin de obtener extractos apoplásticos que puedan ser usados para análisis proteómicos. Para ello, usando tallos y raíces de clavel, se evaluaron parámetros claves para la extracción de estas proteínas. Se determinó que para esta especie (Dianthus caryophyllus L.) se debe usar la solución amortiguadora fosfato de sodio 0,1 M pH 6,5, cloruro de sodio 50 mM y 0,1% β-mercaptoetanol para la infiltración; con tres tiempos de vacío de 20 s a 70 kPa y centrifugación a 1000 x g durante 20 min a 4 °C, seguido de precipitación y concentración de proteínas con el método Ácido tricloroacético/acetona. Bajo estas condiciones, se obtienen extractos que permiten análisis electroforéticos en 2D de proteínas de apoplasto, usando para el isolectroenfoque tiras con gradientes de pH 5-8 para raíz y pH 3-10 para tallo. Las condiciones descritas permitirán profundizar sobre el papel de las proteínas apoplásticas en diversidad de fenómenos biológicos que involucren esta especie vegetal.
Abstract In the present study a workflow, that can be applied to different plant species, to obtain a high quality apoplastic extract and for proteomic analysis is described. For that, using carnation roots and stems, some important parameters for the extraction of these proteins were evaluated. The best conditions for the infiltration were provided by using a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.5, 50 mM sodium chloride and β -mercaptoethanol 0.1%, with 3 vacuum times at 70 kPa for 20 s and centrifuged at 4°C at 1,000 g for 20 min, and then a subsequent protein precipitation and concentration with the Trichloroacetic acid/acetone protocol. These conditions can be used to obtain a good quality extract for 2D electrophoretic analysis of apoplastic proteins. Strips with pH gradients between 5-8 and 3-10 were used to run isoelectric analysis for extracts obtained from apoplast in roots and stems, respectively. The conditions described can be used to perform studies focused on apoplastic proteins and its role in biological phenomena involving this plant species.
Resumo No presente estudo, é descrito um fluxo de trabalho que pode ser aplicado a espécies vegetais diferentes, para obter extratos apoplásticos que podem ser utilizados para análise proteômico. Para isto, utilizando os caules e as raízes do cravo, foram avaliados parâmetros considerados chave para a extração destas proteínas. Foi determinado que para esta espécie, deve ser utilizada uma solução tampão de fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5 com cloreto de sódio 50 mM e 0,1% β-mercaptoetanol para a infiltração; com três aplicações de vácuo de 20 s a 70 kPa e centrifugação a 1000 x g por 20 minutos a 4°C, e subsequente precipitação e concentração de proteínas usando Ácido ricloroacético/acetona. Nestas condições se podem obter extratos que permitem a análise eletroforética 2D de proteínas do apoplasto utilizando para a focalização isoeléctrica tiras com gradientes de pH 5-8 para a raiz e de pH 3-10 para o caule. As condições descritas permitirão aprofundar sobre o papel das proteínas apoplásticas numa diversidade de fenômenos biológicos que envolvem esta espécie de planta.
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Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
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En este estudio se determinó la composición química de los aceites esenciales de hojas de Ocotea longifolia y O. macrophylla obtenidos mediante destilación por arrastre convapor, yse evaluó la actividad antifúngica e insecticida de los aceites esenciales para estimar su uso como posibles plaguicidas. El rendimiento del aceite esencial de O. longifolia fue superior al 0,2%, mientras que el rendimiento del aceite esencial de O. macrophylla fue inferior al 0,1%. El análisis de los aceites por CG/EM permitió la identificación de α-terpinoleno (80,91%) y α-felandreno (4,74%) como componentes principales del aceite O. longifolia, y espatulenol (15,91%), γ-muuroleno (15,4%) y biciclogermacreno (14,58%) como los principales componentes de O. macrophylla. El aceite esencial de O. longifolia mostró actividad fumigante significativa contra Sitophilus zeamais (CL50 280,5 µL/L aire). Adicionalmente se evaluó la actividad antifúngica de los aceites esenciales, encontrándose un bajo efecto inhibidor en el crecimiento de los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum f. sp. dianthi y Botrytis cinerea.
This study determined the chemical composition of the essential oils isolated from leaves of Ocotea longifolia and O. macrophylla by steam distillation and the antifungal and insecticide activities of essential oils as potential pesticides were tested. The yield of essential oil of O. longifolia was more than 0.2%, while the essential oil yield of O. macrophylla was less than 0.1%. GC/MS analysis allowed the identification of α-terpinolene (80.91%) and α-phellandrene (4.74%) as the main constituents of O. longifolia oil, and spathulenol (15.91%), γ-muurolene (15.4%) and bicyclogermacrene (14.58%) as the major constituents of O. macrophylla. The essential oil of O. longifolia showed significant fumigant activity against Sitophilus zeamais (LC50 280.5 µL/L air), and could become an alternative to synthetic pesticides for controlling this pest. The antifungal activity of the essential oils also was evaluated. The essential oils showed low inhibitory effect on the growth of the phytopathogen fungi Fusarium oxysporum f. sp. dianthi and Botrytis cinerea.
Neste estudo nós determinamos a composicào química dos óleos essenciais das folhas de Ocotea longifolia e O. macrophylla obtidas por destilacáo a vapor e avaliaram a atividade antifúngica e inseticida de óleos essenciais para estimar a sua possível utilizacào como pesticidas. O rendimento do óleo essencial de O. longifolia foi superior a 0,2%, enquanto o rendimento doóleo essencial de O. acrophylla foi inferior a 0,1%. A análise dos óleos por CG/EM permitiu a identificacáo de α-terpinolene (80,91%) e α-felandreno (4,74%) como os principais componentes do óleo de O. longifolia, e espatulenol (15,91%), γ-muuroleno (15,4%) e biciclogermacreno (14,58%) como os principais componentes do óleo de O. macrophylla. O óleo essencial de O. longifolia mostraram atividade significativa contra Sitophilus zeamais (CL50 280,5 µL/L ar), e pode se tornar uma alternativa aos inseticidas sintéticos para o controle desta praga. A atividade antifúngica de óleos essenciais também foi avaliada. Os óleos essenciais de O. longifolia e O. macrophylla apresentaram baixo efeito inibitório sobre o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum f. sp. dianthi e Botrytis cinerea.
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Se estudió por ensayos in vitro la posible participación de las enzimas endopoligalacturonasa (PG) (EC.3.2.1.15) y pectato liasa (PL) (EC.4.2.2.2), consideradas factores de virulencia en el proceso de infección del clavel por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD). Los resultados muestran la inducción de la expresión de la enzima PG en presencia de los inductores artificiales, ácido poligalacturónico (APG) y pectina, y un nivel de expresión muy bajo en cultivos con pared celular (PC) de clavel de variedades resistente y susceptible. La enzima PL no presentó expresión en presencia de inductores artificiales (APG y pectina), mientras que en cultivos inducidos con pared celular de raíz presentó un alto nivel de expresión.
The Polygalacturonase (PG; EC 3.2.1.15) and the Pectate lyase (PL; EC 4.2.2.2) are considered as factor of virulence. These enzymes were studied during the infection process of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD) on Carnation (Dianthus caryophillus L.) using culture medium in vitro. The results show the induction of the expression of the PG enzyme when the artificial inductors polygalacturonic acid (APG) and pectin are present. The level of expression was very low in culture with cellular wall (PC) of carnations of the resistant and susceptible varieties. The PL enzyme did not show expression in the presence of artificial inductors (APG and pectin) but in induced culture with root and cellular wall showed a high level of expression.