Immune response and biochemistry of calves immunized with rMSP1a ( Anaplasma marginale) using carbon nanotubes as carrier molecules / Resposta imunológica e bioquímica de bezerros imunizados com rMSP1 a (Anaplasma marginale) utilizando nanotubos de carbono como moléculas carreadoras

Abstract Vaccination against Anaplasma marginale has been considered an important control strategy for bovine anaplasmosis. Recently, mice immunized with rMSP1 a linked to carbon nanotubes (MWNT) showed significant immune responses, generating a new possibility for use of an inactivated vaccine. The objective of this study was to investigate the cellular and humoral responses in calves immunized with MWNT+rMSP1a , associated with inactivated vaccine of A. marginale produced in vitro, and evaluate the toxic effects of the MWNT on renal and hepatic function. rMSP1a was covalently linked to MWNT. Inactivated vaccine (AmUFMG2) was produced by cultivating A. marginale in IDE8 cells. Twenty-four Holstein calves were divided (four groups) and immunized subcutaneously with PBS and non-carboxylated MWNT (control, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1a (G3), and AmUFMG2 with MWNT+rMSP1a (G4). Blood samples were collected for total leukocyte counts, biochemical profiling and evaluation of the cellular and humoral response. Immunization with MWNT+rMSP1a induced increase in the total number of leukocytes, NK cells, in the lymphocyte populations and higher levels of antibodies compared to calves immunized only with AmUFMG2. Furthermore, MWNT did not induce changes in the biochemical profile. These data indicate that MWNT+rMSP1a were able to induce the immune responses more efficiently than AmUFMG2 alone, without generating toxicity.

Resumo Vacinação contra Anaplasma marginale tem sido considerada uma importante estratégia de controle da anaplasmose bovina. Recentemente, camundongos imunizados com rMSP1a funcionalizada à nanotubos de carbono (MWNT) apresentaram resposta imune significante, gerando nova possibilidade para o uso da vacina inativada. O objetivo desse estudo foi investigar a resposta celular e humoral em bezerros imunizados com MWNT+rMSP1a, associado com a vacina inativada de A. marginale produzida in vitro, e avaliar os efeitos tóxicos dos MWNT nas funções hepática e renal. rMSP1 a foi ligada covalentemente aos MWNT. Vacina inativada (AmUFMG2) foi produzida através do cultivo de A. marginale em células IDE8. Vinte e quatro bezerros Holandeses foram divididos (quatro grupos) e imunizados subcutaneamente com: PBS e MWNT não-carboxilados (controle, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1 a (G3), e AmUFMG2 com MWNT+rMSP1a (G4). Amostras de sangue foram coletadas para contagem de leucócitos, perfil bioquímico e avaliação da resposta celular e humoral. Imunização com MWNT+rMSP1a induziu aumento dos leucócitos totais, células NK, na população de linfócitos e altos níveis de anticorpos comparado com animais imunizados apenas com AmUFMG2. Além disso, MWNT não induziu alterações no perfil bioquímico. Esses dados indicam que MWNT+rMSP1a foram capazes de induzir eficientemente a resposta imune comparado com AmUFMG2 sozinho, sem gerar toxicidade.

Outbreak of anaplasmosis associated with the presence of different Anaplasma marginale strains in dairy cattle in the states of São Paulo and Goiás, Brazil / Surto de anaplasmose associado com a presença de diferentes cepas de Anaplasma marginale em gado leiteiro dos estados de São Paulo e Goiás, Brasil

Abstract The present study reports the genetic diversity of Anaplasma marginale during anaplasmosis outbreaks in rural properties of the states of Goiás and São Paulo, Brazil. Mortality rates of 3.5% (37/1,050) in calves, 4.7% (45/954) in heifers and 1.1% (25/2,200) in lactating cows were observed in a cattle herd of the municipality of Mambaí, state of Goiás, central-western Brazil. In a cattle herd from the municipality of Lins, state of São Paulo, in southeastern Brazil, none of the animals died, despite presenting clinical signs suggestive of bovine anaplasmosis and exhibiting a drastic decrease in milk production. Thus, blood samples were collected from 100 animals with clinical signs suggestive of bovine anaplasmosis in the municipalities of Mambaí and Lins. Based on the microsatellite structure of the MSP1a of A. marginale, the genotypes E and H were observed in Lins, and the C, D and E genotypes were found in Mambaí. The analysis of the tandem repeat structures of the MSP1a showed nine different strains (τ-10 -15, α-β2, α-β3-13, α-β2 192, τ-β-100, α-β2-Γ, 193-β-100, 191-13-Γ and 191-13-18) in Lins and two (α-β3-Γ and E-F-φ2-F2) in Mambaí. Three new tandem repeats of MSP1a (191, 192 and 193) were described. The τ-10-15 and α-β3-Γ strains were predominantly associated with the occurrence of clinical anaplasmosis and mortality in calves, heifers and lactating cows.

Resumo O presente estudo relata a diversidade genética de Anaplasma marginale durante surtos de anaplasmose bovina no Brasil em propriedades localizadas nos Estados de Goiás e São Paulo. No rebanho bovino de Mambaí, Estado de Goiás, Centro-oeste do Brasil, observaram-se taxas de mortalidade de 3,5% (37/1050) nos bezerros; 4,7% (45/954) nas novilhas e 1,1% (25/2200) nas vacas em lactação. No rebanho bovino de Lins, Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil, embora os animais tenham apresentado sinais clínicos sugestivos de anaplasmose bovina, culminando em redução drástica da produção leiteira, nenhum animal veio a óbito. Assim, amostras de sangue de 100 bovinos com sinais clínicos sugestivos de anaplasmose foram coletadas em Mambaí-GO e Lins-SP. Baseando-se na estrutura do microssatélite da MSP1a de A. marginale, observou-se a presença dos genótipos E e H em Lins e C, D e E em Mambaí. A análise da estrutura em “tandem repeats” da MSP1a mostrou nove diferentes estirpes (τ-10 -15, α-β2, α-β3-13, α-β2 192, τ-β-100, α-β2-Γ, 193-β-100, 191-13-Γ e 191-13-18) em Lins e duas (α-β3-Γ e E-F-φ2-F2) em Mambaí. Três novos “tandem repeats” da MSP1a (191, 192 e 193) foram descritos. Foi observado predomínio das estirpes τ-10-15 e α-β3-Γ associado à ocorrência de anaplasmose clínica e mortalidade em bezerras, novilhas e vacas em lactação.

Immune response of calves inoculated with proteins of Anaplasma marginale bound to an immunostimulant complex / Resposta imune de bezerros inoculados com proteínas de Anaplasma marginale ligadas a um complexo imunoestimulante

Despite our current knowledge of the immunology, pathology, and genetics of Anaplasma marginale, prevention in cattle is currently based on old standbys, including live attenuated vaccines, antibiotic treatment, and maintaining enzootic stability in cattle herds. In the present study, we evaluated the use of an immunostimulant complex (ISCOMATRIX) adjuvant, associated with a pool of recombinant major surface proteins (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 and rMSP5) to improve the humoral immune response triggered in calves mainly by IgG2. Ten calves were divided in three groups: 4 calves were inoculated with the ISCOMATRIX/rMSPs (G1); 2 calves were inoculated with ISCOMATRIX adjuvant (G2); and 4 calves received saline (G3). Three inoculations were administered at 21-day intervals. In G1, the calves showed significant increases in total IgG, IgG1 and IgG2 levels 21 days after the second inoculation, compared to the control group (p < 0.05), and G1 calves remained above the cut-off value 28 days after the third inoculation (p < 0.05). The post-immunized sera from calves in G1 reacted specifically for each of the rMSPs used. In conclusion, the ISCOMATRIX/rMSPs induced antigen-specific seroconversion in calves. Therefore, additional testing to explore the protection induced by rMSPs, both alone and in conjunction with proteins previously identified as subdominant epitopes, is warranted.

Apesar dos avanços da imunologia, patologia e genética de Anaplasma marginale, a prevenção em bovinos ainda é baseada nas vacinas vivas atenuadas, na terapia com antibiótico e estabilidade enzoótica dos rebanhos bovinos. No presente estudo, avaliou-se o uso de um complexo imunoestimulante (ISCOMATRIX), associado às proteínas recombinantes de superfície (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 e rMSP5) para melhorar a resposta imune humoral desencadeada em bezerros, principalmente por IgG2. Dez animais foram divididos em três grupos: 4 bezerros foram inoculados com o ISCOMATRIX/rMSPs (G1), 2 bezerros foram inoculados com ISCOMATRIX adjuvante (G2) e 4 bezerros receberam salina (G3). Três doses vacinais foram administradas em intervalos de 21 dias. No G1, os bezerros apresentaram aumentos significativos nos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 21 dias após a segunda inoculação, em comparação com o grupo de controle (p <0,05). Nos bezerros do G1 esses níveis de anticorpos permaneceram acima do ponto de corte 28 dias após a terceira inoculação (p < 0,05). Os soros pós-imunização de bezerros do G1 reagiram especificamente com cada uma das rMSPs utilizadas. Em conclusão, o ISCOMATRIX/rMSPs induziu soroconversão antígeno-específica em bezerros. Portanto, se justifica a realização de ensaios adicionais para explorar a proteção induzida pela rMSPs, tanto sozinhas como em conjunto com novas proteínas identificadas com epítopos subdominantes.

Detection of genetic diversity of Anaplasma marginale isolates in Minas Gerais, Brazil / Detecção de diversidade genética de isolados Anaplasma marginale em Minas Gerais, Brasil

Bovine anaplasmosis, caused by the tick-borne rickettsiaAnaplasma marginale, is endemic in tropical and subtropical regions of the world and results in economic losses in the cattle industry. Major surface proteins (MSPs) have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and demonstrate that many isolates may occur in a given geographic area. However, in Brazil, little is known about the genetic diversity of A. marginale isolates within individual herds. This study was designed to examine the genetic variation among A. marginale infecting calves in a farm in the south of Minas Gerais State, Brazil. Blood samples collected from 100 calves were used to prepare Giemsastained smears that were microscopically examined for the presence of A. marginale. From each blood sample, DNA was extracted and analyzed by a polymerase chain reaction (PCR), followed by sequencing to determine diversity among the isolates. Examination of blood smears showed that 48% of the calves were infected with A. marginale, while the real-time PCR detected 70.2% positivity. Congenital infections were found in four calves. The microsatellite and tandem repeat analyses showed high genetic diversity among the isolates.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale e transmitida por carrapatos, é endêmica em regiões tropicais e subtropicais no mundo e causa grandes perdas econômicas na indústria de bovinos. Proteínas principais de superfície (MSPs) foram usados como marcadores para a caracterização genética de amostras de A. marginale, demonstrando que diferentes isolados podem ocorrer numa certa região geográfica. Porém, no Brasil pouco se sabe sobre a variedade genética de isolados de A. marginale em rebanhos individuais. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de variação genética entre bezerros infectados com A. marginale numa fazenda do sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de sangue coletadas de 100 bezerros foram utilizadas para o preparo de esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa, para detecção da infecção por A. marginale. Amostras de DNA extraídas de cada amostra foram analisadas através de PCR seguido de sequenciamento. O exame dos esfregaços demonstrou que 48% dos bezerros estavam infectados com A. marginale, enquanto que o PCR detectou 70,2% de positividade. Infecção congênita foi detectada em quatro bezerros. As análises de microsatélites e 'tandem repeats' comprovaram uma grande diversidade genética entre os isolados.

Induced immune response of Escherichia coli BL21 expressing recombinant MSP1a and MSP1b proteins of Anaplasma marginale

This work aims to evaluate the potential of immunization with E. coli BL21 expressing the recombinant rMSP1a and rMSP1b proteins of Anaplasma marginale. E. coli BL21 was transformed with recombinant plasmids pET102/msp1α and pET101/msp1β, and rMSP1a and rMSP1b were expressed after induction by IPTG. BALB/c mice were vaccinated with formolized BL21/rMSP1a and BL21/rMSP1b, and the production in mice sera of whole IgG was determined by ELISA. The mice immunized with BL21/rMSP1a showed a better humoral response for whole IgG when compared to the mice immunized with BL21/rMSP1b; these mice exhibited a small response after the second vaccination. Sera of mice immunized with BL21/rMSP1a reacted via western blot with BL21 and rMSP1a, with molecular masses varying from 70 to 105 kDa. Sera of mice immunized with BL21/rMSP1b reacted with BL21 and rMSP1b with a molecular mass of 100 kDa. These results demonstrate that BL21 containing rMSP1a and rMSP1b in the outer membrane were able to produce an immune response in mice, reinforcing its use in vaccine models against bovine anaplasmosis.

Esse trabalho avaliou o potencial de imunização de Escherichia coli BL21 expressando as proteínas recombinantes rMSP1a e rMSP1b de Anaplasma marginale. A E. coli BL21 foi transformada com os plasmídios recombinantes pET102/msp1α e pET101/msp1β e as proteínas rMSP1a e rMSP1b foram expressas após indução com IPTG. Camundongos BALB/c foram vacinados com BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b formolisadas, e a produção de IgG total foi determinada pelo teste de ELISA nos soros dos camundongos imunizados. Os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1a mostraram uma melhor resposta humoral para IgG total, comparada à resposta apresentada pelos camundongos imunizados com BL21/rMSP1b; estes camundongos exibiram uma menor resposta após a segunda vacinação. Soros de camundongos imunizados BL21/rMSP1a reagiram pelo western blot com BL21 e rMSP1a, com massa molecular variando de 70 a 105 kDa. Soro de camundongos imunizados com BL21/rMSP1b reagiram com BL21 e rMSP1b com massa molecular de 100 kDa. Esses resultados demonstram que BL21 contendo rMSP1a e rMSP1b na membrana externa foram capazes de produzir resposta imune em camundongos, reforçando o seu uso em modelos de vacina contra a anaplasmose bovina.