Evaluation of quantitative polymerase chain reaction for the detection of Toxoplasma gondii oocysts shed by cats / Avaliação da reação em cadeia da polimerase quantitativa para a detecção de oocistos de Toxoplasma gondii eliminados por gatos

Abstract Felines are definitive hosts of Toxoplasma gondii and can shed oocysts in their feces, contaminating the environment. Sporulated oocysts are highly resistant to the environment and have higher infectivity, which are attributed to many toxoplasmosis outbreaks. The aim of the present study was to evaluate a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique for the detection of T. gondii oocysts shed by cats. Twelve cats from a previous vaccine experiment were challenged orally with 600 cysts of the TgDoveBr8 strain on day 72. Fecal samples were collected daily using the centrifugal flotation technique, with microscopic examination (Sheather technique) and qPCR for 20 days after the challenge. Cats from all groups shed oocysts in their feces. Five negative cats in the Sheather were positive according to qPCR on the 3rd day post-inoculation (dpi). Oocysts were detected on the 4th dpi using the Sheather; however, there was no statistical difference between the two methods (p=0.1116). In addition, there was no statistically significant difference in oocyst shedding between the groups according to the Sheather technique (p=0.6534) and qPCR (p=0.9670). In conclusion, these results demonstrate that qPCR can be used as an alternative to the Sheather to detect and quantify T. gondii oocysts.

Resumo Felinos são hospedeiros definitivos do Toxoplasma gondii e podem eliminar oocistos nas fezes, contaminando o meio ambiente. Oocistos esporulados são altamente resistentes ao meio ambiente com elevada infectividade, sendo atribuído a muitos surtos de toxoplasmose. O objetivo do estudo foi avaliar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a detecção de oocistos de T. gondii eliminados por gatos. Doze gatos de um experimento prévio de vacina foram desafiados por via oral com 600 cistos da cepa TgDoveBr8 no dia 72. Amostras fecais foram coletadas diariamente pela técnica de centrifugo-flutuação seguida de exame microscópico (técnica de Sheather) e qPCR por 20 dias após desafio. Gatos de todos os grupos eliminam oocistos nas fezes. Cinco gatos negativos na técnica Sheather foram positivos de acordo com a qPCR no 3º dia pós-inoculação (dpi). Oocistos foram detectados no 4º dpi no Sheather; entretanto, não houve diferença estatística entre os dois métodos (p=0,1116). Não houve diferença estatisticamente significativa na eliminação de oocistos entre os grupos de acordo com a técnica de Sheather (p = 0,6534) e qPCR (p = 0,9670). Em conclusão, esses resultados demonstram que qPCR pode ser usada como uma alternativa ao Sheather para detectar e quantificar oocistos de T. gondii.

Occurrence of gastrointestinal parasitic diseases of swine in different production phases in commercial pig farms from the State of Santa Catarina, southern Brazil / [Ocorrência de parasitoses gastrointestinais dos suínos, nas diferentes fases de produção, em granjas comerciais de Santa Catarina, Brasil]

Gastrointestinal parasites are important, since they can cause a decrese in the performance of swine. The occurrence of parasites in pig farms can create economic losses such as reduction in the value of carcasses and increasing expenses with medicines and veterinary assistance. This study aimed at investigating the occurrence of intestinal parasites in different phases of production reared pigs in intensive prodution systems in the western region of the State of Santa Catarina. A total of 403 fecal samples were analyzed, of which 51.86% were positive for one or more parasites in different phases of production. Finishing pigs had the highest prevalence of parasites (60.19%) followed by nursery pigs (55.44%), pigs in breading sows (50.49%), and suckling piglets (40.81%). Strongylida parasites had higher occurrence (28.78%), and were also the most frequent in the finishing, breading sows, and nursery phases. Coccidia were more occurrent in suckling piglets. This study highlights the need of implementing suitable antiparasitic control measures in all phases of swine production associated with a surveillance system for the diagnosis of endoparasite infection in pigs. Our results demonstrate that endoparasites are highly occurring in pigs, even in intensive system animals on technified farms.(AU)

Parasitas gastrointestinais são importantes, pois podem causar uma diminuição no desempenho dos suínos. A ocorrência de parasitas em granjas de suínos pode gerar perdas econômicas, como redução no valor das carcaças e aumento de gastos com medicamentos e assistência veterinária. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de parasitas intestinais nas diferentes fases de produção de suínos criados em sistemas intensivos, na região oeste do estado de Santa Catarina. Foram analisadas 403 amostras fecais, das quais 51,86% foram positivas para um ou mais parasitas nas diferentes fases de produção. Os suínos de terminação apresentaram a maior prevalência de parasitas (60,19%), seguidos por suínos de creche (55,44%), suínos em gestação (50,49%) e leitões em lactação (40,81%). Parasitas da ordem Strongylida tiveram maior ocorrência (28,78%) e também foram os mais frequentes nos estágios de terminação, reprodução e creche. Coccídios foram mais ocorrentes em leitões lactentes. Este estudo destaca a necessidade de implementar medidas de controle antiparasitário adequadas em todas as fases da produção suína, associadas a um sistema de vigilância para o diagnóstico de infecção por endoparasitas em suínos. Os resultados demonstram que os endoparasitas são altamente ocorrentes em suínos, mesmo em animais de criação intensiva em granjas tecnificadas.(AU)

Diagnóstico de criptosporidiose em amostras fecais de bezerros por imunofluorescência direta e microscopia de contraste de fase / Diagnosis of cryptosporidiosis in fecal samples of calves using direct immunofluorescence and phase contrast microscopy

O presente estudo teve como objetivo comparar as técnicas de imunofluorescência direta (IFD) e a microscopia de contraste de fase em solução de Sheather (MCF), para detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de bezerros. A determinação dos limiares detecção da IFD e da MCF foi realizada utilizando cinco alíquotas de uma amostra fecal de bezerro, comprovadamente negativa para Cryptosporidium spp., adicionadas com diferentes quantidades de oocistos de Cryptosporidium parvum. Ao exame das 5 alíquotas, a IFD e a MCF apresentaram, respectivamente, limiares de detecção de 3,3x104 (duas alíquotas positivas) e 3,3x105 oocistos (1 alíquota positiva) por grama de fezes. Foram também realizadas a comparação entre a positividade obtida e uma análise semiquantitativa do número de oocistos observados por campo de microscopia, em ambos os métodos, em 300 amostras fecais de bezerros. Entre as 300 amostras, 19,7 por cento (59/300) foram positivas pela IFD, com diferença estatisticamente significante (P=0,0098) quando comparada com a positividade obtida pela MCF, que foi de 11,7 por cento (35/300). As amostras positivas foram submetidas à reação em cadeia da polimerase para amplificação de fragmentos da subunidade 18S do rRNA, com posterior sequenciamento dos fragmentos amplificados, o que permitiu a identificação de Cryptosporidium andersoni em 11,9 por cento (7/59) e de C.parvum em 88,1 por cento (52/59) das amostras. Os resultados observados comprovam que a IFD foi mais eficiente que a MCF para detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de bezerros.

This study aimed to compare the direct immunofluorescence assay (DIF) and the phase contrast microscopy in Sheather solution (PCM) for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples from calves. The determination of the thresholds of detection of DIF and PCM was performed using five aliquots of a fecal sample from a calf negative for Cryptosporidium spp. oocysts, spiked with different amounts of Cryptosporidium parvum oocysts. The screening of the five aliquots revealed that the DIF and MCF showed respectively, detection thresholds of 3.3x104 (2 positive aliquots) and 3.3x105 (1 positive aliquot) oocysts per gram of fecal sample. Further analyses were accomplished in order to compare the positivity results and to determine semi-quantitatively the number of oocysts per field of microscopy, in both methods, in 300 fecal samples from calves. Among the 300 samples, 19.7 percent (59/300) were positive by DIF, result that was statistically significant (P=0.0098) when compared with the positivity obtained by the PCM, which was 11.7 percent (35/300). The positive samples were submitted to the nested-PCR assay for amplification of fragments of the 18S subunit of rRNA, following sequencing of amplified fragments, allowing the identification of Cryptosporidium andersoni in 11.9 percent (7/59) and C. parvum in 88.1 percent (52/59) of the samples. The present results indicate that the DIF was more effective than PCM in the detection of Cryptosporidium in fecal samples from calves.