Immunogenicity of Streptococcus equi subsp. equi recombinant SeM protein and bacterin in mice

ABSTRACT: The infection caused by Streptococcus equi, known as strangles, affects the respiratory system of horses, causing high morbidity and rapid spread among the herd. Bacterin vaccines, composed of inactivated whole cells of S. equi, have variable efficacy and duration. Infected animals produce specific antibodies against SeM, the immunodominant antigen of S. equi. This makes it a promising target for vaccine development. In this context, the objective of this work was to evaluate a vaccine combining S. equi bacterin and recombinant SeM protein. Mice were vaccinated with bacterin (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); rSeM protein (20g); bacterin-rSeM combination; or PBS (Control Group) and challenged with a suspension of S. equi, containing 10 × LD50. All vaccinated mice survived the challenge and produced anti-rSeM and anti-S. equi antibodies, which were assessed by indirect ELISA. The Control Group reached endpoint criteria 96 h after infection. These results demonstrate that a vaccine combining the S. equi bacterin with rSeM protein protects mice against strangles. This combination vaccine could potentially protect horses and overcome the limitations of currently available strangle vaccines.

RESUMO: A infecção causada por Streptococcus equi, denominada adenite, atinge o sistema respiratório de equinos, causando alta morbidade e rápida disseminação entre o rebanho. Vacinas bacterinas, compostas de células inteiras inativadas de S. equi apresentam eficácia e duração variáveis. Animais infectados apresentam anticorpos específicos à proteína SeM, antígeno imunodominante de S. equi, o que a torna um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma vacina baseada na administração simultânea da bacterina e da proteína SeM recombinante. Camundongos foram vacinados com a bacterina (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); a proteína rSeM (20g); a bacterina e rSeM simultaneamente; ou PBS (Grupo Controle) e, posteriormente, foram desafiados com uma suspensão de S. equi contendo 10 × LD50. Todos os animais vacinados apresentaram anticorpos anti-rSeM e contra S. equi, avaliados através de ELISA indireto, e mantiveram-se e sobreviveram ao desafio letal. O Grupo Controle atingiu critérios de endpoint 96 h após a infecção. Estes resultados demonstram que uma vacina constituída de células inteiras de S. equi com rSeM protege camundongos contra adenite, sugerindo a capacidade de proteção a equinos e, possivelmente, superando as limitações das vacinas contra adenite atualmente disponíveis.

Immunogenicity of Streptococcus equi subsp. equi recombinant SeM protein and bacterin in mice / Imunogenicidade da proteína recombinante SeM de Streptococcus equi subsp. equi e da bacterina em camundongos

The infection caused by Streptococcus equi, known as strangles, affects the respiratory system of horses, causing high morbidity and rapid spread among the herd. Bacterin vaccines, composed of inactivated whole cells of S. equi, have variable efficacy and duration. Infected animals produce specific antibodies against SeM, the immunodominant antigen of S. equi. This makes it a promising target for vaccine development. In this context, the objective of this work was to evaluate a vaccine combining S. equi bacterin and recombinant SeM protein. Mice were vaccinated with bacterin (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); rSeM protein (20μg); bacterin-rSeM combination; or PBS (Control Group) and challenged with a suspension of S. equi, containing 10 × LD50. All vaccinated mice survived the challenge and produced anti-rSeM and anti-S. equi antibodies, which were assessed by indirect ELISA. The Control Group reached endpoint criteria 96 h after infection. These results demonstrate that a vaccine combining the S. equi bacterin with rSeM protein protects mice against strangles. This combination vaccine could potentially protect horses and overcome the limitations of currently available strangle vaccines.(AU)

A infecção causada por Streptococcus equi, denominada adenite, atinge o sistema respiratório de equinos, causando alta morbidade e rápida disseminação entre o rebanho. Vacinas bacterinas, compostas de células inteiras inativadas de S. equi apresentam eficácia e duração variáveis. Animais infectados apresentam anticorpos específicos à proteína SeM, antígeno imunodominante de S. equi, o que a torna um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma vacina baseada na administração simultânea da bacterina e da proteína SeM recombinante. Camundongos foram vacinados com a bacterina (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); a proteína rSeM (20μg); a bacterina e rSeM simultaneamente; ou PBS (Grupo Controle) e, posteriormente, foram desafiados com uma suspensão de S. equi contendo 10 × LD50. Todos os animais vacinados apresentaram anticorpos anti-rSeM e contra S. equi, avaliados através de ELISA indireto, e mantiveram-se e sobreviveram ao desafio letal. O Grupo Controle atingiu critérios de endpoint 96 h após a infecção. Estes resultados demonstram que uma vacina constituída de células inteiras de S. equi com rSeM protege camundongos contra adenite, sugerindo a capacidade de proteção a equinos e, possivelmente, superando as limitações das vacinas contra adenite atualmente disponíveis.(AU)

"Cell ELISA" como ferramenta auxiliar no controle da adenite equina / "Cell ELISA" as an auxiliary tool for the control of equine adenitis

Este trabalho relata o desenvolvimento e a avaliação de um ensaio imunoenzimático (ELISA) como ferramenta auxiliar no controle da adenite equina. Foi avaliada a presença de anticorpos anti-Streptococcus equi subsp. equi em equinos com doença clínica de garrotilho, portadores assintomáticos e potros vacinados. Equinos doentes demonstraram absorbâncias médias superiores (P<0,05) às médias observadas nas demais categorias examinadas. Equinos portadores assintomáticos apresentaram valores médios de absorbância superiores (P<0,05) aos animais com cultura negativa. Logo após a vacinação, potros apresentaram elevação nos níveis de anticorpos, seguida de um decréscimo nos níveis 90 dias após a segunda vacinação. O "Cell ELISA" foi eficiente para a detecção de anticorpos em equinos expostos a antígenos de S. equi, diferenciando-se de infecções por S. zooepidemicus. O "Cell ELISA" mostrou-se uma alternativa clínica para o diagnóstico indireto da adenite equina, diferenciando-se, entre equinos assintomáticos, os potenciais portadores da infecção. Os resultados observados em potros vacinados confirmam o potencial de utilização desse teste como ferramenta em programas de vacinação contra garrotilho pelo monitoramento de rebanhos pós-vacinação. Esses resultados sugerem que o "Cell ELISA" é uma promissora ferramenta auxiliar no controle da adenite equina.(AU)

This study reports the development and evaluation of the use of "Cell ELISA" as a tool for clinical interpretation for the control of strangles. The presence of anti-S. equi antibodies was evaluated in horses with strangles, in asymptomatic carriers and in vaccinated foals. Equine positive for strangle showed higher average of absorbance (P<0.05) when compared with the average for the other categories of horses studied. Asymptomatic S. equi equine carriers had higher average of absorbance (P<0.05) than equines with negative culture. After vaccination, foals presented an increase in antibody levels, followed by a decrease in antibody levels 90 days post the second vaccination. The "Cell ELISA" was efficient for the detection of antibodies in horses exposed to S. equi antigens, differentiating infections with S. zooepidemicus. Thus, the test might be a clinical tool for indirect diagnosis of the strangles, differentiating, between the asymptomatic horses, the potential carriers of infection. The results observed in vaccinated foals confirm the potential use of this test as an auxiliary instrument for strangles vaccination programs based in the serological monitoring of the herd after immunization. These results suggest that the "Cell ELISA" is a promising auxiliary tool in the control of equine adenitis.(AU)

Imunogenicidade da proteína M recombinante de Streptococcus equi subsp. equi coadministrada com um adjuvante molecular / Immunogenicity of recombinant M protein of Streptococcus equi subsp. equi co administered with a molecular adjuvant

The strangles is an infectious disease that affects horses from all ages and causes important economic losses in the equine-related business. The aim of this work was to evaluate the immunogenicity of the recombinant M protein from Streptococcus equi (rSeM) co-administered with the recombinant heat-labile enterotoxin B subunit from Escherichia coli (rLTB) in mice and horses. A total of 72 female Balb-c mice were divided into eight groups and 18 horses were divided into six groups. The animals were inoculated by intramuscular (IM) or intranasal (IN) routes with different treatments of rSeM, rLTB and/or Al(OH)3. The results obtained in both species, independent of administration routes, demonstrated that rSeM + rLTB had higher levels of specific serum immunoglobulins, however, in mucosal immunity the increase was not identified. Thus, the use of rSeM as vaccine antigen and rLTB as adjuvant can be a potential tool in the control of equine strangles.(AU)

Primary bilateral guttural pouch empyema in a two-month-old foal / Empiema de bolsa gutural primário bilateral em potro de dois meses

The present report describes a 2-month-old foal which signs of respiratory infectious disease, bilateral retropharyngeal swelling and nasal mucopurulent discharge, suggesting guttural pouch empyema. The owners reported that the foal lived in a herd that experienced an outbreak of strangles. Foals younger than 3 months are usually protected against infectious diseases, however in this case, the foal was exposed to an environment heavily populated by Streptococcus equi equi during the outbreak of strangles. Although uncommon in such young animals, the foal was infected and developed a primary bilateral guttural pouch empyema, without signs of lymph nodes alteration.

O presente trabalho descreve o caso de um potro de dois meses de idade com sinais de infecção respiratória, distensão bilateral da região retrofaríngea e secreção nasal mucopurulenta, sugerindo empiema de bolsa gutural. Os proprietários relataram que o potro pertencia a uma tropa que havia sido acometida por garrotilho recentemente. Potros com menos de 3 meses de idade são normalmente protegidos contra as doenças infecciosas, no entanto, este potro foi exposto a um ambiente altamente contaminado por Streptococcus equi equi durante o surto de garrotilho. Embora incomum em animais tão jovens, o potro foi infectado e desenvolveu um empiema primário de bolsa gutural, não havendo sinais de acometimento dos linfonodos.

Cloning, expression and characterization of SeM protein of Streptococcus equi subsp. equi and evaluation of its use as antigen in an indirect ELISA / Clonagem, expressão e caracterização de proteína SeM de Streptococcus equi subsp. equi e avaliação de sua utilização como antígeno em um ELISA indireto

Strangles is an economically important horse disease caused by Streptococcus equi subsp. equi. The diagnosis can be confirmed either directly by bacterial isolation and PCR or by ELISA, which is an indirect method based on the detection of serum antibodies. The aim of this study was to clone, express and characterize the SeM protein of Streptococcus equi subsp. equi, evaluate its use as antigen in indirect ELISA and determine its performance to distinguish sera of negative, vaccinated and positive animals. This was initially performed by cloning the gene encoding the SeM protein and its expression in Escherichia coli. Subsequently, the protein produced was characterized and used as antigen in ELISA. Serum samples for evaluation were taken from 40 negative foals, 46 horses vaccinated with a commercial vaccine against strangles and 46 horses diagnosed with the disease. The test showed high specificity and sensitivity, allowing discrimination between negative and positive, positive and vaccinated animals, and vaccinated animals and negative sera. Thus, it was concluded that the protein produced rSeM, which can be used as antigen for disease diagnosis, and the described ELISA might be helpful to evaluate the immune status of the herd...

A adenite equina é uma enfermidade economicamente importante de equinos, causada por Streptococcus equi subsp. equi. Seu diagnóstico pode ser confirmado de forma direta, por meio de isolamento bacteriano e de PCR, ou de forma indireta, por meio de ELISA, método baseado na detecção de anticorpos séricos. O objetivo deste estudo foi clonar, expressar e caracterizar a proteína SeM de Streptococcus equi subsp. equi, avaliar sua utilização como antígeno em um ELISA indireto e determinar a capacidade do teste de distinguir soros de animais negativos, vacinados e positivos. Para tal, foi inicialmente realizada a clonagem do gene que codifica para a proteína SeM e sua expressão em Escherichia coli. Posteriormente, a proteína produzida foi caracterizada e utilizada como antígeno em um teste de ELISA indireto. Para avaliação do teste, foram utilizadas amostras de soro de 40 potros negativos, de 46 equinos vacinados com uma vacina comercial contra adenite equina e de 46 equinos com diagnóstico da doença. O teste demonstrou alta sensibilidade e especificidade, permitindo discriminar entre soros negativos e positivos, positivos e de animais vacinados, e negativos e de animais vacinados. Assim, conclui-se que a proteína rSeM produzida pode ser usada como antígeno para o diagnóstico da enfermidade e que o ELISA descrito pode ser útil para avaliar o estado imunológico do rebanho...

Perfil fenotípico e susceptibilidade antimicrobiana de Streptococcus equi isolados de equinos da região Sul do Brasil / Phenotypic profile and antimicrobial susceptibility of Streptococcus equi isolated from horses in southern Brazil

As características fenotípicas [morfológicas, bioquímicas, susceptibilidade aos antimicrobianos, índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA), concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) da benzilpenicilina] de 38 isolados de Streptococcus equi oriundos de amostras clínicas de animais com adenite equina foram alvo deste estudo. A fenotipia demonstrou três padrões de colônias, três biotipos de fermentação de carboidratos e variação de 0 a 0,4 no IRMA. Todos os isolados de S. equi demonstraram sensibilidade à penicilina, tanto pelo método de disco difusão quanto pelo método de microdiluição. A CIM e CBM média de benzilpenicilina foi de 0,0095μg/mL e 0,0267μg/mL para S. equi subesp. equi e de 0,0128μg/mL e 0,0380μg/mL para S. equi subesp. zooepidemicus. Os valores de CIM e CBM diferiram entre as subespécies (p<0,05). O diâmetro do halo de inibição de penicilina demonstrou relação com a CIM (ì=0,03638 - 0,00072x) para S. equi subesp. equi. Também foi demonstrada relação entre o diâmetro do halo de inibição de penicilina com a CBM para S. equi subesp. equi (ì=0,10931- 0,00223x). Entretanto para as amostras de S. equi subesp. zooepidemicus esta relação somente foi verificada para a CBM (ì=0,1322 - 0,00271x). A CIM de benzilpenicilina frente às amostras isoladas da região Central, Planalto e Sul do estado do Rio Grande do Sul foram estatisticamente semelhantes, mas diferiram do isolado do estado do Paraná, sugerindo o caráter atípico desta cepa. Todos os isolados de S. equi são sensíveis à penicilina e sulfazotrim, confirmando a eleição destes antimicrobianos para o tratamento das infecções por este agente na clínica veterinária. Os resultados obtidos não dispensam a utilização prudente dos antimicrobianos.

Phenotypic characteristics [morphology, biochemical fermentation, antimicrobial susceptibility, index of multiple resistances to antimicrobials (IMRA), minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of benzilpenicillin] of 38 Streptococcus equi isolates from clinical samples of horses with strangles were the aim of this study. The phenotypic analyses demonstrated three colony patterns, three carbohydrate fermentation biotypes and IMRA variation from 0 to 0.4. All the isolates of S. equi demonstrated sensitivity to penicillin, both by the disc diffusion method and microdilution method. The average MIC and MBC for benzilpenincillin were of 0.0095μg/mL and 0.0267μg/mL for S. equi subsp. equi and of 0.0128μg/mL and 0.0380μg/mL for S. equi subsp. zooepidemicus. The values of MIC and MBC differed between the subspecies (p<0.05). The diameter of penicillin inhibition halo demonstrated a relation with the MIC (ì=0.03638 - 0.00072x) for Streptococcus equi subsp. equi. A relation between the diameter of the inhibition halo of penincillin was also observed with the MBC for S. equi subsp. equi (ì=0.10931 - 0.00223x). However for the samples of S. equi subsp. zooepidemicus this relation was only verified with the MBC (ì=0.1322 - 0.00271x). The MIC of benzilpenicillin of the samples isolated from the Central, Planalto and South regions of Rio Grande do Sul were statistically similar, although different from the Paraná state sample, suggesting the atypical character of this strain. All the S. equi isolates are sensitive to penicillin and sulfazotrim, confirming these as antibiotics of choice for the treatment of infections caused by this agent in the clinical veterinary practice. The results obtained do not discard the prudent use of antimicrobials.

Adenite equina: sua etiologia, diagnóstico e controle / Strangles: etiology, diagnosis and control

A adenite equina, também conhecida como garrotilho, é uma enfermidade bacteriana contagiosa, causada por Streptococcus equi, subsp. equi, bactéria β hemolítica do grupo C de Lancefield, que afeta o trato respiratório anterior de equinos de todas as idades, com maior prevalência entre um e cinco anos de idade. Caracteriza-se por produzir secreção mucopurulenta das vias aéreas anteriores e linfadenite dos gânglios retrofaríngeos e submandibulares com formação de abscessos. Fatores de virulência de S. equi, subsp. equi, incluem cápsula de ácido hialurônico, hialuronidase, estreptolisina O, estreptoquinase, receptores para Fc de IgG, peptidoglicano e proteína M. Dentre esses fatores, a proteína M tem especial importância por ser de membrana com propriedades antifagocitárias e de aderência. A doença tem baixa letalidade e alta morbidade e seus prejuízos econômicos devem-se à perda de performance e custo do tratamento. O diagnóstico clínico e o tratamento não apresentam dificuldades, mas a profilaxia é prejudicada pela baixa eficiência das vacinas disponíveis, com índices de proteção de 50 por cento. O garrotilho pode ocorrer em todas as épocas do ano, mas o frio e a umidade facilitam a sobrevivência do agente e sua disseminação, portanto animais que vivem nos estados mais frios e úmidos do país são mais vulneráveis à infecção. Novas vacinas utilizando antígenos purificados ou de subunidades estão sendo desenvolvidas com a finalidade de incrementar sua potência e evitar efeitos indesejáveis. A comprovação de diferenças de antigenicidade, entre estirpes, alerta sobre a importância da seleção apropriada das cepas vacinais.

Strangles is a contagious disease of the respiratory tract of horses produced by Streptococcus equi subsp. equi, a Lancefield's group C β haemolytic bacterium. It produces a mucopurulent secretion of the anterior airways, as well as lymphadenitis and abscesses. The bacteria synthesizes several pathogenicity factors such a hyaluronic acid capsule, hyaluronidase, streptolisin O, streptokinase, IgG Fc receptors, peptidoglican and protein M. Among these factors, protein M deserves special importance due to its antifagocitic and adherence properties. The disease has high morbidity and low lethality, and produces economic losses due to low performance and treatment. Clinical diagnosis and treatment are done easily, but prophylaxis is hampered by the low potency of vaccines, that protect around 50 percent of vaccinated animals. Strangles may occur during all the year, but cold and humid weather favors the survival of streptococci, making animals that live in regions with those characteristics more prone to infection. New vaccines using purified or subunit antigens have been developed aiming to increase their potency and to avoid undesirable side effects. The demonstration that bacteria strains show differences in their antigenicity, called attention on the selection of appropriate strains to use as antigens.

Immunogenicity and cross reactivity indices of Streptococcus equi subsp. equi strains isolated from cases of Strangles and commercial vaccines / Imunogenicidade e índices de reatividade cruzada de cepas de Streptococcus equi subsp. equi isoladas de casos de Adenite Eqüina e vacinas comerciais

Horse Strangles appears frequently in animals vaccinated with commercial bacterins in Rio Grande do Sul, Brazil. Aiming to know the antigenic relationships of strains recovered from sick animals among them and with two vaccines profusely used in the state, bilateral cross reactivity indices (CRI) were estimated. In addition, the immunogenicity of vaccines prepared with field isolates and commercial vaccines was tested in mice. Antibody titers were measured by ELISA and expressed as seroconversions. Thirteen strains of Streptococcus equi subsp. equi, nine classified biochemically as typical and other four as atypical strains, were recovered from 35 sick horses belonging to 10 herds of Rio Grande do Sul, Brazil. The strains recovered from sick horses showed very close CRI, suggesting antigenic homogeneity among them, but not with the vaccinal strains. A vaccine produced with an atypical strain induced the highest seroconversion, 9.4, while two produced with typical strains were poorly-immunogenic. The commercial vaccines were less immunogenic than five and four vaccines produced with field strains, inducing seroconversions of 2.6 and 3.8, respectively.

A Adenite Eqüina é freqüente em animais vacinados com bacterinas comerciais no Rio Grande do Sul. Com o objetivo de determinar as relações antigênicas entre cepas isoladas de casos clínicos e duas vacinas amplamente utilizadas no Estado, foram determinados os índices de reatividade cruzada bilateral (IRC) entre elas. Também foi determinada a imunogenicidade em camundongos de vacinas preparadas com cepas de campo e de vacinas comerciais. Os títulos de anticorpos foram determinados por ELISA e expressos como soroconversão. Foram isoladas 13 cepas de Streptococcus equi subsp. equi de 35 casos clínicos de Adenite Eqüina em 10 diferentes rebanhos do Rio Grande do Sul, Brasil, das quais nove foram classificadas bioquimicamente como típicas e outras quatro como atípicas. As cepas de campo apresentaram elevada reatividade cruzada, sugerindo homogeneidade antigênica entre elas, mas não com as cepas vacinais. Uma vacina produzida com cepa atípica induziu soroconversão de 9.4, enquanto duas vacinas produzidas com cepas típicas foram pouco imunogênicas. As vacinas comerciais induziram soroconversões de 2.6 e 3.8, menores que quatro e cinco vacinas produzidas com cepas de campo, respectivamente.